NF-κB抑制剂PDTC对小鼠急性心肌梗塞后Wnt信号通路的影响

　　【摘要】 目的：探讨核转录因子(NF)-κB抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)对小鼠急性心肌梗塞(AMI)后Wnt信号通路的影响。方法：结扎3月龄雄性C57/BL小鼠左冠状动脉建立AMI模型，随机分成AMI+PDTC组(36只，术后每日腹腔注射PDTC 120mg/kg)，AMI组(36只，每日注射同上述剂量的生理盐水)。所有小鼠按心梗时间分3 d、7 d、14 d亚组，比较应用PDTC后NF-κB信号通道相关的p65，Wnt信号通路的Dishellved(dvl)-1 mRNA表达，糖原合成激酶(GSK)-3β总水平及磷酸化水平变化，β-连接蛋白(catenin)及缝隙通道连接蛋白(connexin)43表达。结果：与AMI 组相比，AMI+PDTC组的p65，dvl-1 mRNA表达显著降低(P均<0.05),p/t GSK-3β 3 d，7 d及14 d时均显著升高(P值均为0.000);βcatenin表达3 d时显著低于AMI组，7 d时显著高于AMI组(P值均为0.000);connexin 43表达显著降低(P=0.000)。结论：抑制NF-κB活性、信号通道后Wnt信号通路相关蛋白活性也发生变化，说明急性心肌梗塞后NF-κB信号通路与Wnt信号通路之间存在互通作用。

　　【关键词】 心肌梗塞;NF-κB;小鼠

　　Effects of NF-κB inhibitor-PDTC on Wnt signal pathway in mice postinfarction /HUANG Ying,MA Yitong, YANG Yining，LIU Fen,CHEN Bangdang, LI Xiaomei//Department of Coronary Artery Disease， The 1st Affiliated Hospital，Xinjiang Medical University，Urumqi，Xinjiang，830054，China

　　Corresponding author: MA Yi-tong, Email：myt-xj@163.com

　　Abstract：Objective:To study the effects of NF-κB inhibitor -PDTC on expression of protein related to Wnt signal pathway in mice post-infarction.Methods:Choose 3 months C57/BL mice to set up acute myocardial infarction animal model by ligation of left coronary artery .They were divided to AMI+PDTC group(36 cases, mice was treated with injected PDTC on dose of 120 mg/kg·d)and AMI group (36 cases, mice was treated with injected physiological saline with same volume).They were divided into 3 subgroups according to time postinfarction: 3d, 7d, 14d post infarction and detected expression of p65 related to NF-κB signal pathway by immunohistochemistry; and protein related to Wnt signal pathway: dvl-1 mRNA by RT-PCR, total (t)and phosphorylation (p) level of glucogen synthesis kinase(GSK)-3β，β-catenin，connexin 43 by Westernblot in left ventricular. Results: Expression of p65 decreased in AMI+PDTC group (P<0.05). Compared with AMI group expression of dvl-1 mRNA decreased in AMI+PDTC group(P<0.05).While ratio of p/t- GSK-3β was higher in AMI+PDTC group on 3d,7d and 14d postinfarction than it in AMI group (P=0.000 all). Expression of β-catenin was lower on 3d postinfarction，and increased on 7d post- infarction (P=0.000) in AMI+PDTC group.Expression of connexin 43 was much lower in AMI+PDTC group compared with AMI group(P=0.000). Conclusion: Expression of protein related to Wnt signal pathway also altered after used NF-κB inhibitor -PDTC.That means “crosstalk” existed between Wnt and NF-κB signal pathway post-infarction.

　　Key words：Myocardial infarction;NF-κB;Mice

　　Wnt 信号通路是一个调节生物体生长、发育、疾病、衰老及细胞分化、凋亡等过程的重要途径，其经典途径通过激活dvl-1基因抑制糖原合成酶(GSK)-3β活性，导致β-连接蛋白(β-catenin)降解减少，入核影响目的基因如c-myc, cyclin D1及缝隙通道连接蛋白(connexin) 43等表达，参与急性心肌梗塞(AMI)后梗塞区愈合、心肌重构过程[1]。研究发现AMI后dvl-1，β-catenin表达增加，而connexin 43先降低后升高说明心梗后Wnt信号通路被激活[2]。另外，AMI后核转录因子(NF)-κB信号通路相关炎症因子肿瘤坏死因子(TNF)-α，白介素(IL)-1，6表达增加[3]，NF-κB DNA结合活性增加，提示AMI后NF-κB通路被激活。Wnt通路与多条信号通路间存在互通“crosstalk”，其中与NF-κB信号通路间的互通已在平滑肌细胞及肿瘤细胞中证实[4]，AMI后上述两条通路都被激活，是否也存在Wnt通路与NF-κB信号通路间的互通，尚未见报道。本研究通过在AMI小鼠模型中应用NF-κB抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)观察Wnt信号通路相关蛋白的变化，探讨这两条通路在心梗时的互通。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料

　　(1)实验动物：选择近交系3月龄C57BL小鼠72只，体重25～30g，由新疆医科大学实验动物中心提供[生产许可证号SCXK(新)2003-0001]。所有操作程序经过动物伦理委员会批准;(2)试剂与仪器：总蛋白提取及蛋白定量试剂盒购自北京百泰克公司。免疫组化试剂盒产自福州迈新生物科技开发有限公司。抗兔的p65、β-catenin、 p/t GSK-3β、connexin 43及磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的单抗均购自美国Cell Signaling Technology公司。Western印迹法检测试剂盒购自美国Invitrogen公司。逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR) 引物由上海生工合成。Hardvard 687小动物呼吸机产自美国Hardvard公司。凝胶成像分析仪产自美国Bio-rad公司，灰度分析采用Quantity One图像分析软件。

　　1.2 方法

　　1.2.1 实验动物分组：将72只C57BL小鼠随机分为两组，每组36只。

　　(1)AMI+PDTC组：麻醉后开胸结扎左冠状动脉建立AMI模型,详细步骤如文献所述[3]。术后将PDTC用灭菌水配制成浓度为5mg/ml溶液，按120mg/kg·d 剂量给心梗后小鼠进行腹腔注射;(2)AMI组：手术步骤同前，术后每日按同等剂量注射生理盐水。根据心梗时间分为3 d、7 d、14 d组(每时间组24只，AMI及AMI+PDTC组各12只)，在设计的时间处死小鼠，取出心脏，游离左心室，多聚甲醛固定或液氮冻存后转入-80℃冰箱保存备用。

　　1.2.2 免疫组化检测：用p65抗体作为一抗免疫动物制备第二抗体，并用生物素处理后加显色剂DAB将抗原抗体反应部位显示出来，在光镜下观察到表达阳性部位棕黄着色。根据阳性细胞的分布情况，每张切片拍摄5个阳性视野，每例标本的切片随机选取5个400倍视野，计算出平均阳性细胞数。

　　1.2.3 Western 印迹法检测：提取左室心肌蛋白或核蛋白，以BCA法测定蛋白浓度，加样总蛋白量为40μg, 以上样缓冲液等体积稀释，4℃冰浴下以十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)进行电泳，4℃湿转到NC膜上，常规洗膜封闭，孵育相应一抗(一抗均1∶1000稀释，二抗1∶2000稀释)，然后加入碱性磷酸酶显色剂，根据颜色变化及时终止显色反应。用Quality图像分析系统对Western印迹图片进行分析，以GAPDH的蛋白含量作为参照。

　　1.2.4 RT-PCR检测dvl-1 mRNA表达：提取总RNA后鉴定RNA纯度，dvl-1 mRNA引物：采用文献报道的引物序列， 5′CAGGGATGCGAGGTTA 3′，5′AAGGGAGGCAAGAAAGT 3′由上海生工科技有限公司合成。逆转录合成cDNA，退火温度55℃，35个循环进行PCR扩增，扩增产物进行鉴定，分析。Dvl-1 mRNA大小约130bp。

　　1.3 统计学处理

　　采用SPSS 13.0 统计软件分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，多个样本均数的比较用方差分析，组间两两比较用S-N-K检验，P<0.05为差异有显著性。

　　2 结 果

　　2.1 PDTC对小鼠心肌梗塞后p65表达的影响

　　心梗后3 d，与AMI组相比，AMI+PDTC组p65阳性细胞数明显减少(u=55.48，P<0.05);心梗7 d时，AMI+PDTC组p65阳性细胞数总数仍少于AMI组(u=53.60，P<0.05)。AMI+PDTC组p65阳性细胞数随心梗时间延长而明显降低，心梗3 d明显高于7 d(u=2.36，P<0.05)(图1，见封三)，表1。表1 PDTC对小鼠心肌梗塞后p65阳性细胞数影响注：AMI：急性心肌梗塞，PDTC：二硫代氨基甲酸吡咯烷。与AMI组比较△P<0.05;与3 d组比较，▲P<0.05。

　　2.2 PDTC对老龄小鼠心肌梗塞后dvl-1 mRNA的影响

　　AMI+PDTC组心梗后各时间点dvl-1 mRNA表达均明显低于AMI组(P值分别为0.002,0.016和0.000)。AMI组随心梗时间延长表达逐渐增加，3 d<7 d<14 d(P值分别为0.002，0.000，0.001)。AMI+PDTC组心梗7 d时表达比3 d及14 d均高(P值分别为0.001，0.004)，3 d与14 d时比较差异无显著性(P=0.333)。(图2，表2)。表2 PDTC对小鼠心肌梗塞后dvl-1 mRNA表达相对值的影响注： 与3 d组比较△P<0.05;与7 d比较▲P<0.05;与AMI组比较#P<0.05。

　　2.3 PDTC对老龄小鼠心肌梗塞后p/t GSK-3β的影响

　　心梗后3d、7d、14d AMI+PDTC组 p/t GSK-3β均明显高于AMI组(P均<0.01)[见图3、图4(下页)]。AMI组心梗不同时间 p/t GSK-3β差异无显著性(P值分别为0.114，0.101，0.946)。AMI+PDTC组 p/t GSK-3β各组差异均无显著性(P值分别为0.841，0.063，0.091)。

　　2.4 PDTC对老龄小鼠心肌梗塞后βcatenin的影响

　　AMI+PDTC组β-catenin 3 d时表达明显低于AMI组(P=0.018)，而7 d时明显高于AMI组(P=0.000)，14 d时两组表达无显著性(P=0.08)(见图3，4)。AMI组心梗后3 d时较7 d表达高(P=0.000)，但与14 d比较差异无显著性(P=0.143);7 d时明显低于14 d(P=0.000)。AMI+PDTC组各时间占差异无显著性(P=0.154)。

　　图3 PDTC对急性心肌梗塞后wnt信号通路相关蛋白GSK-3β、β-catenin的影响

　　2.5 PDTC对老龄小鼠心肌梗塞后connexin 43的影响

　　AMI+PDTC组心梗后各时间点表达均明显低于AMI组(P值均为0.000)。(见图3，4)。AMI组心梗后7 d时低于3d、14d(P=0.000)，但3d、14 d差异不显著(P>0.05);AMI+PDTC组7 d时表达明显低于3 d及14 d时，3 d时表达明显低于14 d时，差异有显著性(P值均为0.000)。

　　3 讨 论

　　AMI后心室重构涉及复杂的病理生理机制，目前研究集中于基质金属蛋白酶(MMP)家族[5]、肾素-血管紧张素(RAS)系统[6]及细胞凋亡[7]、炎症反应，主要是NF-κB通路[8，9]等。此外，细胞粘附功能也与心室重构关系密切，尤其是Wnt通路中的dvl蛋白及β-catenin对于维持梗塞心脏的完整性至关重要[1]。已经在肿瘤中证实Wnt通路与NF-κB通路存在“互通”[4]。NF-κB抑制剂PDTC可以减轻心肌缺血再灌注损伤[10]、抑制TNF-α及IL-10等炎症因子表达[11]，并降低Ⅲ型胶原表达，改善心室重构[12]，AMI后应用NF-κB抑制剂PDTC是否也会对Wnt通路蛋白表达产生影响，尚未见报道。注：与AMI组相比△P<0.05。

　　本研究通过在小鼠AMI模型中应用PDTC后发现：NF-κB的必需成分p65表达降低，证明PDTC起到了抑制NF-κB活性的作用。继而检测Wnt通路相关dvl-1 mRNA表达发现：AMI+PDTC组与AMI组比较心梗后各时间点dvl-1 mRNA表达均降低。随着NF-κB活性降低dvl-1 mRNA表达下调，说明dvl-1 mRNA表达也受到了来自于NF-κB通路的正向调节，但dvl-1对于维持心肌完整性是必须的，dvl-1表达降低将导致高心脏破裂率[1]，而实际上几乎所有的研究均提示PDTC可以改善心肌梗塞后的左室重构，目前的研究结果还解释不了这种前后矛盾的现象。迄今尚未见到有关NF-κB通路与dvl-1表达相关的报道，NF-κB通路通过什么机制调节dvl-1的表达，还需要更多的研究来揭示。

　　GSK-3是一种丝/苏氨酸蛋白激酶,存在于各种细胞中,参与多种信号转导通路调节,在胚胎发育、细胞分化、肿瘤形成等多方面发挥重要作用。目前至少发现了Wnt及NF-κB这两条转导通路与该酶联系紧密。GSK-3β能使β-catenin磷酸化以致被泛素-蛋白酶系统所识别,从而降解β-catenin,使胞质中游离的β-catenin含量减少,达到抑制基因转录的目的[13]。研究发现GSK-3β有促进NF-κB转录激活的能力，还可以通过磷酸化NF-κB亚基RelA上调NF-κB的转录激活能力[14]。但关于NF-κB活性是否会影响GSK-3β功能，尚未见相关报道。本研究应用PDTC后发现，心梗后3d AMI+PDTC组p/t GSK-3β 3 d，7 d及14 d均高于AMI组(P值均为0.000)。说明NF-κB抑制剂同时还影响了GSK-3β的活性，即影响了Wnt信号通路的功能。有研究显示TNF-α可以诱导GSK-3β磷酸化 [15]，PDTC抑制TNF-α诱导的NF-κB活性，且抑制TNF-α mRNA表达，理论上应该使GSK-3β磷酸化水平降低，这与我们所做的结果又是矛盾的，提示PDTC对GSK-3β的作用可能不是通过抑制TNF-α实现的。

　　近来关于NF-κB通路与β-catenin之间交互作用在肿瘤中的研究较多[16]，但关于AMI后NF-κB通路与β-catenin表达之间的研究较少。本研究发现应用PDTC后β-catenin：AMI+PDTC组3 d的表达低于AMI组，而7 d的高于AMI组，14 d时两组表达无差异。β-catenin表达与P-GSK-3β之间呈正相关， 这与AMI+PDTC组β-catenin表达低是相符合的，7 d时该比值升高，而β-catenin也较AMI组高，是一致的，提示PDTC对β-catenin的影响可能是通过影响GSK-3β磷酸化实现的，间接证明PDTC对Wnt信号通路的功能产生了影响。β-catenin最早是作为粘合连接(adhesion junction)的成员被发现的，后来发现它是Wnt信号途径中的关键成员。TNF-α可以诱导GSK-3β磷酸化，因此可以起到稳定β-catenin的作用[15]。PDTC抑制TNF-α mRNA表达，理论上应该使GSK-3β磷酸化水平降低，从而降低β-catenin表达，AMI+PDTC组心梗3 d时β-catenin水平较AMI组降低与此相符，但7 d时却反而升高，考虑有可能与TNF-α 激活后的高峰时间与PDTC组药物的高峰时间不一致有关，因为AMI后TNF-αmRNA表达随时间增加[3]，但PDTC剂量并没有随时间增加，提示我们如果把或其他的NF-κB抑制剂用于科研或治疗时一定要考虑其高峰时间。

　　关于NF-κB通路与connexin43之间的关系研究相对较少，但有研究提示TNF-α通过c-Jun氨基末端激酶通路，而不是NF-κB抑制connexin43表达[17]。本研究发现，应用PDTC后connexin43表达：AMI+PDTC组心梗后各时间点connexin43表达均低于AMI组。应用PDTC后connexin43表达总的趋势较AMI组低，而且7 d时最为明显，这与PDTC抑制TNF-α mRNA表达的时间是一致的，因此PDTC对connexin43的抑制作用可能是通过抑制TNF-α mRNA表达而实现的。心肌细胞之间connexin43广泛存在于心室和心房的细胞连接中。β-catenin能强有力地促进connexin43的转录表达。但是过量生成的connexin43会抑制β-catenin,形成connexin43自身负性调节。因此wnt-β-catenin和connexin43之间可以构成动态的平衡调节机制,维持心肌正常的收缩功能 [18]。本研究结果显示：AMI+PDTC组β-catenin 心梗3 d时表达最低，而connexin43心梗7 d时表达最低，时间点不符，变化趋势也不符，因此推测可能PDTC用后connexin43表达降低不是通过β-catenin的机制，而主要是因为对TNF-α mRNA表达的抑制所导致的。研究显示心肌梗塞后connexin43表达降低对于心肌具有保护作用[19]，因此PDTC 后connexin43较AMI组的进一步降低可能也是PDTC改善心室重构的机制之一。

　　综上所述，AMI后不但NF-κB信号通路及Wnt信号通路均被激活而且这两条通路间还存在互通，究竟这种交互作用的结果是协同还是拮抗，对AMI后左室重构的影响有益还是有害，本研究尚不能定论，有待进一步深入研究证实，但上述这两条通路在心梗后的功能变化研究可为抗心室重构药物的开发提供新的思路和方法。

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