HAPC易感性与HLA-Ⅱ类基因相关性探讨

　　作者：青格乐图 耿排力 张雪峰　贾存文 裴志伟 秦念 张莉 马菊英 作者单位：1.青海省格尔木市人民医院;2. 青海大学医学院

　　【摘要】 　　目的 探讨移居高原汉族男性人群人类白细胞抗原(HLA)Ⅱ类基因中的DQA1、DQB1多态性与其发生高原红细胞增多症(HAPC)的相关性。方法 以48例移居高海拔地区男性HAPC患者和48例移居同地区健康男性为研究对象,应用聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)技术进行HLA-DQA1、-DQB1基因分型，使用SPSS软件分析HLA-DQA1、-DQB1多态性的分布频率及其组间差异。结果 移居高海拔地区的HAPC患者组的HLA-DQA1*0601分布频率与同地区健康对照组相比有统计学意义(χ2=5.547,P<0.05)。而HAPC组和对照组在DQB1*0303、 DQB1*0401、 DQB1*0501等位基因上未显示显著性差异。结论 HLA-DQA1*0601位点可能与HAPC的易感性关联。

　　【关键词】 移居高原汉族人群 HLA-Ⅱ类基因 (DQA1、DQB1) HAPC易感性

　　ASSOCIATION STUDY BETWEEN HAPC SUSCEPTIBILITY AND HLA-Ⅱ GENE POLYMORPHISM

　　Qingge Letu, Geng Paili, Zhang Xuefeng，Jia Cunwen，Pei Zhiwei，Qin Nian，Zhang Li，Ma Juying

　　(1.Department of plateau disease， People's Hospital of Geermu City，Qinghai province;2.Qinghai University Medical College)

　　Abstract Objective To explore whether HLA-DQA1,-DQB1 polymorphisms of Human Leukocyte Antigen (HLA) Class Ⅱgene are associated with the susceptibility of High Altitude Polycythemia (HAPC) in Chinese Han nationality immigrated to plateau area. Methods Peripheral blood samples from 48 cases of HAPC male patients and 48 healthy male individuals from same area with HAPC group were used to genotype HLA-DQA1,-DQB1 genes with polymerase chain reaction using sequence specific primer method (PCR-SSP). The frequency distributions of genotypes between two groups were analyzed by SPSS software. Results The distribution frequency of HLA-DQA1*0601 alleles in HAPC patients group were significantly different from that in control group,Its χ2=5.547,P=0.019. But there were no frequency differences in DQB1*0303、 DQB1*0401、 DQB1*0501 alleles. ConclWusion HLA-DQA1*0601 alleles may associated with the susceptibility of HAPC.

　　Key words Chinese Han nationality HLA-DQA1， -DQB1 gene HAPC Polymorphisms

　　人类白细胞抗原系统(HLA)是具有高度多态性的基因系统，又是首次发现与疾病有明确关系的遗传系统[1]，其中HLA Ⅱ类基因中的DQA1和DQB1座位具有多种免疫学功能和高度的多态性。国内外已经开展的许多有关疾病关联的研究证明， HLA基因不仅与免疫性疾病及肿瘤关联，还发现与心血管疾病、呼吸系统疾病、消化系统疾病、代谢性疾病等有关[2～5]。Hanaoka发现，高原肺水肿易感患者与正常人相比，其HLA-DR6和/或DQ4的两个亚型显著高于对照组[6]，提示高原病的发生与HLA可能存在一定联系。2009年本文作者研究发现HLA-DQA1*0401、*0501位点阳性可能增加患HAPC的危险性[7]。

　　本研究旨在探讨HLA-Ⅱ类基因中的DQA1*0601、 DQB1*0303、 DQB1*0401、 DQB1*0501这四个位点在汉族高原男性移居人群高原红细胞增多症HAPC患者及相应对照人群中的频率分布，分析其与HAPC的发生是否关联。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象

　　所有研究对象均为青藏高原海拔2800 m以上地区移居的男性汉族人群，移居年限平均10～15年，彼此间无血缘关系。病例组：HAPC患者48例，年龄25～55岁，平均年龄(44.13±9.98)岁，患者来自于青海格尔木市第一人民医院2007年1月至2008年9月住院及门诊患者，按2004年第六届国际高原医学和低氧生理学术大会制订的慢性高原病青海诊断标准[8] ， 选择Hb≥210 g/L、Hct≥65% 的HAPC患者作为研究对象，并排除各种急慢性感染,原发性肾肺肝疾患及其他原因所致红细胞增多病例。正常对照组：同海拔高度移居健康居民48例，来自青海格尔木市第一人民医院健康体检人群，年龄、移居时间及地区分布与患者组相当。

　　1.2 基因型检测方法

　　取受检者外周血5 mL,用EDTA抗凝后置液氮罐中保存。采用全血基因组DNA提取试剂盒(北京百泰克生物工程技术公司)从全血中提取基因组DNA;用紫外分光光度计测定DNA浓度及纯度，A260/280值为1.6～1.8,调整终浓度为75～125 mg/L,置-20℃冰箱保存待测。采用聚合酶链反应序列特异性引物技术( PCR-SSP)检测HLA-DQA1和DQB1基因多态性。根据2002年公布的HLA-Ⅱ类等位基因核苷酸序列并根据文献[9]设计4对特异性扩增引物(见表1),对HLA-DQA 1和DQB1等位基因进行扩增鉴定PCR产物。为控制PCR反应的假阴性结果,设计一对内对照基因(人生长激素基因)引物,上游引物: 5′CAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTA3′;下游引物: 5′ATCCACTCACGGATTTCTGTTGTGTTTC 3′,产物片段长度为439 bp。 上述引物均由上海捷瑞生物工程技术公司合成。采用2×PCR TaqMix 扩增试剂盒(广州东盛生物科技有限公司)进行PCR扩增。 PCR扩增体系为25 μL, 含250～500 ng基因组DNA 2 μL,2×PCR TaqMix 12.5 μL(含3mmol/L Mg2 + ) ,10 μmol/L SSP 3 μL, 加ddH2O至25 μL。PCR扩增体系的反应条件为94℃预变性5 min, 94℃变性30 s,60℃～65℃退火45 s～1 min, 72℃延伸1～2 min,共28～32个循环,最后于72℃总延伸7～10 min(最佳退火、延伸温度及时间经预实验反复摸索而定)。在每次反应过程中进行阴性对照及公共引物扩增。PCR扩增产物经含溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶电泳15 min,即刻于凝胶成像分析系统下鉴定PCR产物,根据扩增片段的大小和有无确认受试者相应HLA -DQA 1和DQB1基因型。表1 HLA-DQA1、-DQB1等位基因特异性引物序列及大小(略)

　　1.3 统计学分析方法

　　HLA-DQA1、DQB1等位基因型鉴定采用直接计数法，正常与对照两组间HLA-DQA1、DQB1等位基因频率(GF)=等位基因阳性数/总个体数×2，GF的比较用2×2表行χ2 检验,应用SPSS12.0软件进行数据分析，Pc为组间比较时χ2 检验所获P值的校正值(P值乘以该位点检测的等位基因数)。统计学显著性检验水准α= 0.05。

　　2 结果

　　2.1 PCR扩增的电泳图谱

　　等位基因特异性PCR 产物的长度为117 bp～200 bp,阳性内对照的PCR产物为439 bp (图1) 。

　　2.2 HLA-DQA1和DQB等位基因频率分布

　　HLA-DQA1*0601在HAPC组的分布频率显著高于同地区健康移居人群组(χ2=5.547，P<0.05);而DQB1*0303、 DQB1*0401、 DQB1*0501等位基因在病例组与正常组之间无显著差异。据此可认为，与DQB1*0303、 DQB1*0401、 DQB1*0501等位基因相比,携带DQA1*0601者HAPC发生的风险增加(表2) 。表2　HAPC组和对照组间HLA-DQA1、-DQB1等位基因的频率分布(略)

　　3 讨论

　　HAPC是慢性高原病最常见的一种临床类型,由于机体长期在高原缺氧环境下,红细胞代偿性过度增生,导致血液粘滞度增高,进而引起一系列症状和体征的临床综合征。HAPC发病与海拔高度、性别及民族有很大关系。本病以高原移居者发病最高，男性发病率大大高于女性。高原低氧是本病的基本致病原因，随着海拔高度的升高，患病率呈直线上升 [10]。国内外已经开展的许多有关HLA基因与疾病关联的研究表明，HLA除与自身免疫性疾病及肿瘤相关外，还与其他一些疾病相关，HLA-DQ和-DR基因也与多种疾病关联。HLA不同基因座位的等位基因在某些疾病中以一定的频率出现可能与其连锁不平衡性有关 [11，12]。Hanaoka曾发现，高原肺水肿易感患者与正常人相比，其HLA-DR6和/或DQ4的两个亚型显著高于对照组(P<0.01)。DR6和/或DQ4 阳性者与阴性者对比，前者呈现较高的低氧性肺血管收缩反应和较低的低氧性通气反应 [6];2009年本文作者研究亦发现HLA-DQA1*0401、*0501位点阳性可能增加患HAPC的危险性 [7]。这些提示高原病的发生与HLA可能存在一定的联系 。本研究利用PCR-SSP方法对中国青藏高原汉族男性移居人群的DQA1*0601、 DQB1*0303、 DQB1*0401、 DQB1*0501进行了检测。其中HLA-DQA1*0601等位基因在移居男性人群HAPC组的分布频率显著高于高海拔同地区健康移居人群组，与HLA-DQB1*0303、 DQB1*0401、 DQB1*0501等位基因相比,携带DQA1*0601等位基因者HAPC发生的风险增加，提示携带HLA-DQA1*0601等位基因的个体可能更易发展成为该病，HLA-DQA1*0601的基因多态性可能影响HAPC结局，HLA-DQA1基因位点的多态性较之HLA-DQB1,其与HAPC的相关性更为密切，可能提示HLA-DQA1、-DQB1是HAPC的真正易感基因或抗性基因相连锁的基因位点。本研究所选病例均为男性,有必要在下一步与女性同质人群进行对比研究并扩大样本数量，同时进行有关与HLA其他多态性等位基因的相关性研究，并结合种族、家系等方面进行相关研究,以进一步从基因水平上探讨和揭示HAPC的发病机制。

　　【参考文献】

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