兔眼前段缺血模型的实验研究

　　【摘要】 目的：观察直肌断腱术后兔眼的组织病理学变化，探讨通过直肌断键术制备兔眼前段缺血模型。方法：新西兰白兔24只，随机平均分为A、B、C三组。各组左眼对照，A组切断右眼上、下、内、外四条直肌;B组切断上、下、内三条直肌;C组切断内、外两条直肌。术后第1、14天，每组分别处死4只兔，迅速摘取眼球，作光镜加电子显微镜的组织病理学检查。结果：裂隙灯检查、组织病理学检查均显示各组左眼未发生明显变化。A、B两组右眼前段自术后第一天，均发生了不同程度的缺血性组织病理学变化，其中A组程度更为严重：角膜缘坏死，炎细胞浸润，虹膜睫状体色素上皮脱落、基质出血水肿等。电子显微镜观察显示虹膜、睫状体相应改变。结论：①切断兔眼三或四条直肌可造成兔眼前节组织缺氧改变。②通过直肌断腱术可以制备ASI模型。

　　【关键词】 眼前段缺血;直肌断腱术

　　Experimental Study on Anterior Segment Ischemia in Rabbits

　　Fan Weijie，et al

　　Nanjing City No 1 Haspital(Nanjing 210006)

　　Abstract：Objective：To investigate the histological changes of experimental anterior segment ischemia(ASI)in rabbits，in which tenotomy of various recti was performed.Methods：24 adult New Zealand white rabbits were divided into 3 groups：Group A，B and C.In the right eyes of Group A，B and C，various recti were isolated and sectioned，while in the left ones，nooperation was performed.The eyes were enucleated 1or 14 days after surgery，then fixed with 4% formaldehyde.Morphological change were studied by light and electron microscopy.Results：Mild to severe histological changes of ASI occurred in the the right eyes in Group A，B，while no evident change in the Group C compared with left eyes.Conclusion：Simultaneous tenotomy of 3 or 4 recti causes anterior segment ischemia in rabbits.

　　Key words：anterior segment ischemia(ASI)/rectus tenotomy

　　眼前段缺血(anterior segment ischemia，ASI)是一种很少见但很严重的眼部综合症[1]，常发生于斜视手术(特别是多条直肌离断术后)、视网膜脱离术后，也可发生于化学烧伤后。临床上ASI常发生于术后2-5天，表现为持续眼部疼痛阵发性加剧，视力下降。体征有：角膜水肿;前房纤维蛋白性渗出，房水闪辉阳性;瞳孔对光反射迟钝、节段性或整个虹膜变色。严重时虹膜色素上皮及实质层萎缩、虹膜后粘连，晶体混浊;早期眼压可升高，继之睫状体萎缩，房水生成减少，终致眼球萎缩。对于ASI的治疗，目前常规应用糖皮质激素和散瞳剂，以及降眼压、改善眼前段血循环，增加灌注等。若为视网膜脱离术后者，常松解环扎带。但目前尚无任何证据证明这些措施对病程及视力预后有任何影响，故国外也有学者对于ASI根本不采用任何治疗[2]。目前强调对ASI主要采取以下方法预防：限制每次手术直肌数目、改进手术方法，保留睫状前血管或采用肉毒杆菌素注射来避免手术。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物与分组

　　健康成年新西兰白兔24只，体重2-3kg，雌雄各半。随机平均分为A、B、C三组。左眼对照，未行任何手术;右眼造模。A组切断右眼上、下、内、外四条直肌;B组切断右眼上、下、内三条直肌;C组切断右眼内、外两条直肌。

　　1.2 手术方法

　　1%戊巴比妥(1ml/kg)耳缘静脉麻醉，常规消毒右眼铺洞巾后，爱尔卡因滴眼液表面麻醉。以右眼为试验眼，开睑器开睑，0.25%氯霉素眼药水冲洗结膜囊，消毒棉签吸干结膜囊。沿角膜缘作球360°结膜环形切开，向后分离暴露眼外肌3-5mm。剪开筋膜囊，充分分离节制韧带，用泪道冲洗针头自制的小钩捞起所需眼外肌自其肌腱根部彻底剪断，任其回缩。整复结膜瓣，无需缝合，再次0.25%氯霉素眼药水冲洗结膜囊。

　　1.3 实验观察

　　每天生理盐水清洗结膜囊后，点抗生素眼水，裂隙灯观察眼前段。角膜水肿程度分级[3]：0级为角膜透明无水肿;1级为角膜局限性薄雾状水肿，角膜内皮面光滑，虹膜纹理尚清晰可见;2级为角膜浅灰色水肿，角膜内皮面粗糙，虹膜纹理模糊;3级为角膜弥漫性灰白色水肿，角膜内皮面呈龟裂状，虹膜纹理视不清。

　　1.4 取材

　　术后第1、14天取材。耳缘静脉注空气30ml处死兔子，迅速摘取眼球，清除表面残留筋膜、结膜。光镜标本：于角膜缘穿刺抽取房水0.5ml，往前房内注入等量4%甲醛。再行眼球睫状体平坦部穿刺抽取玻璃体0.5ml-1.0 ml，往玻璃体腔内注入等量4%甲醛，将整个眼球置入4%甲醛固定24-48小时。电镜标本：从眼球上取下虹膜、睫状体，分别将以上组织切成1*1*1 mm小块，2.5%戊二醛固定24小时。

　　2 结果

　　2.1 裂隙灯观察结果

　　各组左眼均无改变。A 组：术后第1天右眼均发生了角膜水肿2-3°，角膜缘紫黑色，见脓性分泌物，虹膜纹理不清，可有点状出血。第3天角膜水肿加重，瞳孔区可见少量渗出(图1)。7-10天后角膜恢复透明，虹膜呈黄色;可见虹膜和角膜缘新生血管长入(图2)。B组：术后第1天右眼角膜水肿1-2°，虹膜纹理不清，瞳孔较对侧缩小。3-5天后透明。C组仅一右眼于术后第1天角膜水肿1°，2天后透明。

　　2.2 光镜结果

　　2.2.1 术后1天

　　各组左眼：角膜缘无充血水肿，无渗出。虹膜、睫状体上皮完整，排列整齐，基质无水肿。A组术眼：角膜缘部角膜基质层及巩膜表层充血、水肿，大量红细胞，炎细胞渗出，以中性粒细胞为主，其中间有少量淋巴细胞，浆细胞。血管扩张，管腔内白细胞增多，并发生附壁、游出。血管周围还可见片状纤维素渗出(图3，4)。虹膜、睫状体上皮细胞变性、呈空泡状，甚至坏死、脱落(图5)，基质充血、水肿，虹膜括约肌水肿，未见明显坏死灶;前房角处亦可见出血(图6)。B组右眼：虹膜、睫状体上皮细胞变性、呈空泡状，甚至脱落。基质充血、水肿。角膜缘水肿，少量炎细胞、红细胞渗出，以中性粒细胞为主。C组右眼：角膜缘略水肿，少量炎细胞渗出，以中性粒细胞为主;虹膜、睫状体轻度充血，上皮细胞排列欠整齐，基质轻度水肿。

　　2.2.2 术后14天

　　各组左眼光镜下无明显组织病理学改变。A 、B组右眼：近角膜缘部浅层巩膜内仍可见大量炎细胞渗出，以淋巴细胞为主。角膜浅层基质内见新生血管及红细胞(图7，8)。虹膜、睫状体上皮仍可见细胞变性、坏死、脱落，基质充血、水肿。C组：角膜缘部浅层巩膜内仍可见少量炎细胞渗出。虹膜、睫状体上皮细胞排列略有不齐。

　　2.3 透射电子显微镜结果

　　2.3.1 虹膜改变

　　各组左眼：虹膜上皮排列整齐，连接紧密;胞浆内含有丰富的线粒体、内质网和高尔基复合体，血管壁上皮细胞连接紧密，基底膜完整，胞浆正常。A、B组：右眼虹膜上皮细胞粒体肿胀、嵴断裂、溶解，严重者呈空泡状(图9)，可见核膜皱缩，溶解(图10)。血管壁上皮细胞间连接疏松，细胞成绒毛样改变。C组：右眼大部分细胞器结构如常，偶有线粒体嵴增宽，内质网扩张，细胞核形状欠规则。

　　2.3.2 睫状体改变

　　各组左眼：睫状体上皮排列整齐，连接紧密;胞浆各种细胞器结构正常;血管壁上皮细胞连接紧密，基底膜完整，胞浆正常。A、B组右眼：睫状体上皮细胞及睫状肌细胞线粒体肿胀，呈空泡状，严重者线粒体嵴断裂、溶解，甚至可见部分核膜溶解。血管壁上皮细胞间连接疏松，细胞成绒毛样改变。(图11，12)C组右眼：睫状体上皮连接疏松，线粒体嵴轻度增宽，内质网扩张，细胞间隙增宽。

　　3 讨论

　　3.1 眼前节的血液供应

　　眼前节系指睫状环与脉络膜交界以前的眼球诸结构，包括角膜、前部巩膜和结膜，虹膜和睫状体、晶体及前后房间隙等。其血液供应主要来自眼的睫状血管系统，即7条随直肌前行的睫状前动脉(anterior ciliary arteries，ACAs)和鼻、颞侧的睫状后长动脉(long posterior ciliary arteries，LPCAs)，内侧象限血液主要来自鼻侧LPCAs，其余部位基本靠上、下ACAs供应，而颞侧LPCAs和ACAs对前节的供应较小[4]。在灵长类动物，眼前节70-80%的血供来自睫状前动脉系统，而两条LPCAs分别在内外直肌下方穿过巩膜，提供约眼前节30%的血供[5]。

　　3.2 ASI模型的制备

　　兔的眼前段血管系统与人类相似，故常被作为理想动物作眼前段血液循环方面的研究[6]。目前国内外多采用以下两种方法来制备ASI模型。(1)热灼法封闭家兔双侧LPCAs：于角膜缘做球结膜环形切开，暴露双侧LPCAs后，用电凝烧灼封闭，将球结膜复位，无需缝合。术后出现了不同程度的角膜水肿，虹膜、睫状体坏死，角膜新生血管长入。(2)直肌断腱术(rectus tenotomy)：于角膜缘做球结膜环形切开，暴露眼外直肌，分离节制韧带，沿肌止点处切断肌肉，任其回缩，将球结膜复位，无需缝合。Ohtsuki[7]用扫描电子显微镜对兔的眼前段微脉管系统研究表明，直肌断腱术后2周出现如虹膜新生血管等轻微的微循环变化，而7周角膜缘表面出现新生血管;双侧LPCAs阻断后2周即出现很明显的眼前段微循环变化。他认为，直肌断腱术对兔的眼前段脉管系统能产生双侧LPCAs阻断同样的变化，ACAs同样参与兔眼前段的血供，而且与LPCAs的联系可能比此前文献报道的还要多。而国内麦光焕等已在显微镜下成功分离出兔ACAs，并在未分离保留ACAs的情况下同时切断新西兰白兔3-4条直肌造成了不同程度的ASI(早期角膜水肿，眼压下降，房水混浊，虹膜粘连，晶体混浊，晚期新生血管布满角膜)。因此他认为，家兔眼前段血液循环虽与人类不完全相同，仍可制作与人类和灵长类有可比性的眼前段缺血动物模型[8，9]。

　　直肌断腱术到底会对眼球产生怎样的影响呢?又是怎样导致了以上那些眼前段缺血表现呢?Ben Simon[10]的研究表明，双眼4条直肌断腱后1天，房水中的电解质，葡萄糖、乳酸盐浓度均发生了改变：钠，钙、葡萄糖浓度升高，钾浓度下降。Dorota[11]同样发现，直肌断腱术后11天房水中钾浓度下降。Ino-ue等[12]用激光闪辉光度测定(laser flare photometry)对兔眼的研究显示，同时切断4条直肌或阻断1-2条涡静脉均可造成血-房水屏障的破坏，闪辉光度(flare value)升高。

　　本试验中，A、B两组右眼分别切断了4、3条(2条垂直+1条水平肌)直肌，术后第1天即出现了角膜水肿，房水混浊，虹膜充血、点状出血、纹理不清，瞳孔缩小，2-3天后角膜水肿甚至加重，晚期即出现了角膜和虹膜的新生血管。组织病理学检查显示角膜缘浅层巩膜充血，炎细胞浸润，红细胞、纤维素渗出，虹膜、睫状体上皮变性、脱落。电子显微镜同样显示虹膜，睫状体的缺血、缺氧改变。C组右眼仅出现了轻微的角膜水肿，2-3天后即消退。组织病理学及电子显微镜检查亦显示虹膜、睫状体无明显改变。以上组织病理学结果与麦光焕等[8]的实验大致相同，但并未出现虹膜粘连，晶体混浊，角膜新生血管也不像后者实验中那样严重。可能是因为实验观察时间短于后者(4周)。总的来说，A、B两组均出现了ASI表现，而A组要重于后者。但B组中有一兔术后第1天即出现角膜水肿3°，甚至重于A组，而另一兔则轻微，4天后即消退了。这可能是由于各个体间的前段循环及对缺血的敏感性存在差异。本实验证明：ACAs参与了兔眼前段的血供，可以通过直肌断腱术的方法来制备ASI模型，也为进一步研究ASI的发病机制奠定了基础。图1，2 裂隙灯显微镜照片图3 角膜缘 HE×100 图4 角膜缘 HE×400图5 睫状体 HE×400 图6 前房角 HE×400图7，8 角膜 HE×400图9，10 虹膜上皮细胞电镜图11 睫状体上皮细镜 图12 睫状肌细胞电镜

　　【参考文献】

　　[1] Saunders RA，Bluestein EC，Wilson HE，et al.Anterior segment ischemia after strabismus surgery[J].Surv Ophthalmol，1994，38：456-466.

　　[2] France TD，Simon JW.Anterior segment ischemia syndrome following muscle surgry：The AAPOS experience[J].J Pediatr Ophthalmol Strabismus，1986，23：87-91.

　　[3] 谢立信，姚瞻，黄钰森，等.超声乳化白内障吸除术后角膜内皮细胞损伤和修复的研究[J].中华眼科杂志，2004，40：90-93.

　　[4] Keough Em，et al.Primate ocular blood flow following contiguous recti tenotomy[J].Ophthalmic Res，1983，15：204-207.

　　[5] KCullis CM，Hines DR，Bullock JD.Anterior segment ischemia：classification and description in chronic myelogenous leukemia[J]. Ann Ophthalmol，1979，11：1739-1744.

　　[6] Peyman GA，Fishman PH，Alexander KR， et al.The effect of ultraviolet，visible and infrared radiation on the rabbit blood-aqueous barrier[J].Exp Eye Res，1986，42：249-254.

　　[7] Ohtsuki H，Hosoda A，Hasebe S，et al.Microvascular change of the anterior eye segment after tenotomy in the rabbit[J].Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol，1997，235：393-398.

　　[8] 麦光焕，李艳娜，余焕云，等.实验性眼前段缺血综合征的组织病理学研究[J].中国斜视与小儿眼科杂志，2003，11：114-116.

　　[9] 麦光焕，李艳娜，余新平，等.实验性眼前段缺血综合征的电镜研究[J].眼科研究，2004，22：57-59.

　　[10] Dorota K，Roman G，Marek P.Influence of rectus eye muscles tenotomy on the aqueous humor composition in rabbits[J]. Med Sci Monit，2000，6：305-308.

　　[11] Ben Simon GJ，Abraham S.Effect of disinsertion of rectus eye muscles on aqueous humor composition in rabbits[J].Ophthalmic Surg Lasers Imaging，2004，35：31-36.

　　[12] D Ino-ue M，Shirabe H，Yamamoto M.Blood-aqueous barrier disruption in experimental anterior segment ischemia in rabbit eyes[J]. Ophthalmic Res，1999，31：213-219.