甲硝唑注射液无菌检查方法的验证

　　作者：王春艳，张显杰 作者单位：哈尔滨三精艾富西药业有限公司(150069)

　　【摘要】 目的：确定甲硝唑注射液的无菌检查方法。方法：按中国药典2005年版二部无菌检查法[1](附录XI H)中薄膜过滤法进行验证。结果：采用薄膜过滤法细菌以500ml/筒冲洗量、真菌以300ml/筒冲洗量检查，在规定条件下敏感菌可正常生长。结论：甲硝唑注射液的无菌检查可采用薄膜过滤法检查(500ml/筒冲洗量)。

　　【关键词】 甲硝唑;方法验证;冲洗量

　　Metronidazole Injection Sterility Test Method Validation

　　Wang Chunyan，et al

　　Harbin Sanjing FAC Pharmaceutical Co，Ltd(150069)

　　Abstract：Objective：To determine the metronidazole injection of sterile screening method.Methods：according to Chinese Pharmacopoeia 2005 Edition 2 sterility test method(Appendix XIH)in the capsule filtration validation.The results of bacteria using membrane filtration method to 500ml / drum washing the amount of fungi in order to 300ml / drum washing the amount of inspection，under specified conditions，normal growth may be susceptible ones.Conclusion：metronidazole injection of sterility test can be used membrane filtration method check(500ml / drum washing volume.

　　Key words：metronidazole;method validation;rinse volume

　　甲硝唑除用于抗滴虫和抗阿米巴原虫外，近年来，广泛地应用于抗厌氧菌感染，对拟杆菌属;梭形杆菌属;梭状芽孢杆菌属，包括破伤风杆菌;部分真杆菌;消化球菌和消化链球菌等厌氧菌有较好的抗菌作用，而对需氧菌或兼性需氧菌则无抗菌作用。根据2005年新版药典的规定[1]，当建立药品的无菌检查时，应进行方法的验证，以证明所采用的方法适用于该药品的无菌检查。笔者针对甲硝唑注射液的抑菌特性采用适宜方法消除其抑菌活性，拟建了该品种的无菌检查方法。

　　1 仪器与材料

　　1.1 仪器 HTY-2000A型集菌仪(杭州泰林生物技术设备有限公司)，全封闭无菌试验过滤培养器(北京牛牛基因有限公司，批号：20090815)。

　　1.2 材料

　　1.2.1 样品 甲硝唑注射液。规格：100ml，0.5g;批号：0912081;样品来源：哈尔滨三精艾富西药业有限公司。

　　1.2.2 培养基和稀释液 北京三药科技开发公司生产的硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基、营养肉汤培养基、改良马丁琼脂培养基、营养琼脂培养基、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液和玫瑰红钠琼脂培养基等。

　　1.2.3 验证试验用菌种 金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26 003](第4代)、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63 501](第4代)、铜绿假单胞菌[CMCC(B)10 104](第3代)、生孢梭菌[CMCC(B)64 941](第4代)、白色念珠菌[CMCC(B)98 001](第4代)、黑曲霉[CMCC(B)98 003](第3代)。

　　2 实验与结果

　　2.1 菌液制备

　　2.1.1 取经30℃～35℃培养18～24h的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的肉汤培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-5～10-7，备用。

　　2.1.2 取经30℃～35℃培养18～24h的生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养基的新鲜培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-7备用。

　　2.1.3 取经23℃～28℃培养24～48h的白色念珠菌液体培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-5～10-6，备用。

　　2.1.4 取经23℃～28℃培养5～7天的黑曲霉斜面培养物，加3～5ml 0.9%无菌氯化钠溶液，洗下黑曲霉孢子，吸取出孢子悬液1ml，加0.9%无菌氯化钠溶液适量稀释，用标准比浊管比浊，其浊度与标准比浊管相当后，取1ml稀释后的孢子悬液，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-4，备用。

　　2.2 实验用菌液检验

　　2.2.1 金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌 取上述金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌10-5～10-7稀释液各1ml，用45℃营养琼脂培养基20ml注皿，各平行测定两皿，30℃～35℃培养48h，做活菌计数。

　　2.2.2 生孢梭菌 取上述生孢梭菌10-7稀释液1ml加至12ml硫乙醇酸盐液体培养基中，30℃～35℃培养18～24h，菌团应清晰可数。

　　2.2.3 白色念珠菌和黑曲霉 取上述白色念珠菌10-5稀释液及上述黑曲霉10-4孢子悬液各1ml，用45℃改良马丁琼脂培养基20ml注皿，各平行测定两皿，23℃～28℃培养，逐日观察，做活菌计数。

　　2.3 过滤与冲洗 取一次性两联过滤器，先用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液少量润湿滤膜，直至液体顺利流出。按规定将样品液滤入滤器，样品液全部过滤完毕后，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗，每次每筒注入冲洗液100ml，充分振摇、荡洗筒壁，完全排空后再循环操作，冲洗总量每筒分别为300ml，500ml，800ml。

　　2.4 培养与观察。分别将硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁液体培养基各100ml滤入相应滤器，将少于100cfu的6种试验菌加入相应滤筒，同时作阳性和阴性对照。分别置规定温度培养5天，逐日记录生长状况，观察不同冲洗量对6株阳性代表菌的影响。

　　2.5 方法的验证采用薄膜过滤法

　　2.5.1 供试液制备　取供试品120瓶，每瓶用10ml0.9%的无菌氯化钠溶液溶解，然后从每瓶中取出4ml置于500ml0.9%的无菌氯化钠溶液中，分别置于七个滤筒中过滤，冲洗液用量为每筒500 ml，每次50ml，在最后一次冲洗中分别加入1ml已制备好的上述7株菌液(约为10～100个/筒)，依照2005年版《中国药典》二部附录XIH无菌检查法，加入相应的培养基，按规定条件培养5天。逐日观察。

　　2.5.2 对照组：另取7个滤筒，分别加入1ml相应的试验菌，再加入相应等量培养基，作为对照，按规定条件培养5天，逐日观察。

　　2.5.3供试品对照组：取供试品40瓶，每瓶用10ml0.9%的无菌氯化钠溶液溶解，然后从每瓶中取出4m置于500ml0.9%的无菌氯化钠溶液中，分别置于2个滤筒中过滤，冲洗滤膜数次，每次50ml，再分别加入硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基，依照2005年版《中国药典》二部附录XIH无菌检查法，按规定条件培养5天，逐日观察。

　　2.5.4 空白对照组：取试验用硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基，按规定条件培养5天，逐日观察。

　　2.5.5 阴性对照组：取冲洗用0.1%蛋白胨缓冲液及0.9%的无菌氯化钠溶液适量，分置于两个滤筒中过滤，再分别加入硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基，按规定条件培养5天，逐日观察。

　　2.5.6 培养：硫乙醇酸盐流体培养基桶30～ 35℃培养;真菌培养基桶23～ 28℃培养，培养 5d。每天观察并记录结果(见表3、4、5)。表3 阴性对照结果表4 24小时观察细菌结果表5 48小时观察真菌结果

　　验证结果。①菌落计数结果，②人工污染金黄色葡萄球菌结果，③人工污染枯草芽孢杆菌结果，④人工污染铜绿假单胞菌结果，⑤人工污染生孢梭菌结果，⑥人工污染白色念珠菌。

　　3 讨论

　　结果表明，甲硝唑注射液按规定取量，人工污染黑曲霉结果表采用薄膜过滤法，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液以300ml/筒的量冲洗，对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌及黑曲霉无明显抑菌活性，均可使其正常生长，而对生孢梭菌的抑菌活性不能完全消除;用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液以500ml/筒的量冲洗，可以消除甲硝唑注射液对生孢梭菌的抑菌作用，使其正常生长。由此得出甲硝唑注射液采用薄膜过滤法进行无菌检查时，pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的冲洗量应为细菌500ml/筒，真菌采用500ml/筒的量冲洗。300ml/筒，以生孢梭菌为阳性对照菌检查，但为方便检查，建议细菌、霉菌均可。

　　【参考文献】

　　[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典，2005年版二部[S].