依达拉奉对大鼠脑出血后水通道蛋白4及血脑屏障的影响

　　作者：孙彬 作者单位：辽宁医学院附属第一医院神经外科，辽宁 锦州 121001

　　【摘要】 目的 研究大鼠脑出血后血脑屏障(BBB)通透性与水通道蛋白4(AQP4)的关系及自由基清除剂依达拉奉的干预作用。方法 采用自体动脉血注入尾状核法制成大鼠脑出血模型，Western blot法观察AQP4的表达，伊文思兰法测量BBB通透性，干湿重法计算脑含水量表示脑水肿。结果 与对照组相比，脑出血组及依达拉奉组BBB通透性均在出血后6h开始升高，l～3d最高，依达拉奉组低于脑出血组(P<0.05);两组AQP4表达也于6h即开始升高，3d时达到高峰，依达拉奉组低于脑出血组(P<0.05);BBB通透性与AQP4表达呈正相关(r=0.585，P

　　【关键词】 脑出血;脑水肿;血脑屏障;水通道蛋白4;依达拉奉

　　Effect of Yidalafeng on Blood—brain Barrier Permeability

　　and AQP4 Expression after Experimental Cerebral Hemorrhage in RatsSUN Bin，YI Fu-xin，ZHANG Shu-heng

　　(Department of Neurosurgery, the First Affiliated Hospital, Liaoning Medical University，Jinzhou 121001 China)【Abstract】 Objective To investigate the relationship between BBB permeability and AQP4, and the effect of Yidalafeng after experimental cerebral hemorrhage(ICH) in rats. Methods The ICH models were established by stereotaxic injection of autologous artery blood into the caudate nucleus. We detected AQP4 expression by Western blot, BBB permeability by EB method and brain water contents by dry-wet weight method. Results In contrast to the control group, BBB permeability increased at 6 hours in ICH group and Yidalafeng group after cerebral hemorrhage, reached peak at 1～3 days，then the Yidalafeng group was lower than the ICH group (P <0.05).AQP4 expression increased at 6 hours in two groups，reached peak after 3 days，then the Yidalafeng group was lower than the ICH group (P<0.05). There was a significantly positive correlation between AQP4 expression and BBB permeability(r=0.585，P< 0.01).They were consistent with the change of cerebral edema. Conclusions After ICH, cerebral edema may be formed through the up-regulation of AQP4 expression and the increase of BBB permeability.Yidalafeng can inhibit the process.

　　【Key words】 cerebral hemorrhage; cerebral edema; blood-brain barrier; aquaporin4;yidalafeng

　　脑出血后除血肿直接破坏脑组织和占位效应引起神经损伤外，脑水肿是造成继发性神经损伤、病情恶化的重要原因之一。水通道蛋白(AQP)是近年来发现的一组与水通透有关的细胞膜转运蛋白，是影响水跨膜转运和细胞内外环境平衡调节的主要膜蛋白[1]，而脑组织中主要为AQP4参与了多种神经系统疾病中脑水肿的形成。同时脑出血后产生的大量氧自由基对神经细胞的损伤及脑水肿的形成有重要作用。但脑出血后AQP4、血脑屏障通透性及自由基三者之间的关系尚未见报道，本实验通过动态观察大鼠脑出血后BBB通透性和AQP4的表达，以及使用抗氧自由基药物依达拉奉后的变化，探讨脑水肿后AQP4与抗氧自由基药物的作用机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　健康SD大鼠75只，体重250～300g，雌雄不限，由本校实验动物中心提供。AQP-4抗体由武汉博士得试剂公司提供，AQP4(H-80)Sc23421由美国Santa Cruz公司提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 实验动物分组

　　随机分成3组：对照组、脑出血组和依达拉奉组。每组按造模后6h、1d、3d、5d、7d时间点分成5个亚组，每亚组5只大鼠。

　　1.2.2 动物模型制作

　　采用大鼠缓慢注射自体血出血模型[2]。术前禁食，自由饮水。麻醉用10%水合氯醛(4mL/kg)腹腔注射。常规局部消毒，将大鼠右后肢近腹股沟处皮肤剪开，暴露、分离股动脉，将三通导管针插入股动脉内，固定，备用。头部皮肤消毒，切开颅顶部皮肤，暴露颅骨并去除骨膜。将大鼠固定在立体定位架上，用牙钻在颅骨钻一直径约2mm的洞，依照Gieorge Paxinos大鼠脑立体定位图谱将注血针通过颅顶骨窗缓慢插入右侧尾状核内，具体坐标为：以前囟为中心，向前0.2 mm，右侧3.5 mm，腹侧5.5 mm。用低浓度肝素处理过的1mL注射器经右侧股动脉导管针抽取新鲜自体血75μL,用微量注射泵经立体定位注射针将75μL新鲜全血缓慢注入右侧尾状核，注血时间控制在(18±2)min。注血完毕后，原位留置注血针10 min以防止血液顺针道反流。缓慢起针，缝合伤口，自然苏醒，麻醉苏醒后出现神经功能缺损症状视为造模成功。对照组步骤同上，只进针不注血。依达拉奉组：于造模后立即经尾静脉注射给药,3mg/kg，以后每十二小时注射1次;脑出血组在相同时间注射等容量生理盐水。

　　1.2.3 脑组织样本的采取

　　在预定的时间内，将大鼠处死，以血肿为中心，将脑组织分为前半、后内、后外3部分。前半部分用于脑含水量的测定;后内部分用于AQP4的测定;后外部分用于血脑屏障通透性的测定。

　　1.2.4 脑含水量测定

　　将各时间点的前半部分脑组织分别称重(湿重)，然后置入100 ℃恒温箱中，24h后取出再称重(干重)。以(湿重-干重)/湿重×100﹪计算脑含水量，以此代表脑水肿的程度。

　　1.2.5 BBB通透性测定

　　按Belayer法[3]使用伊文思兰(evens blue，EB)作为示踪剂。各组动物在处死前2h，按20mg/kg自股静脉注入2﹪ 的EB溶液。后外部分标本称取100mg后加甲酰胺3mL加盖避光在54℃水浴箱中提取24h，提取液在紫外分光光度计下测量光密度值(OD值)，波长为632nm，脑组织EB含量(OD/g湿脑组织)代表BBB通透性。

　　1.2.6 脑组织AQP4的表达

　　Western blot观察：(1)组织样品的制备：各时间点大鼠均采用水合氯醛(4 mL/kg)腹腔注射麻醉，断头取出组织，置于-70℃冰箱中备用。(2)脑组织蛋白质的提取：应用细胞裂解液方法[0.1mol/L NaCl,1mmol/L EDTA,0.01mol/l Tris·HCl,100U/mL抑肽酶(aprotinin),1mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)]。蛋白溶度的测定采用考马斯亮蓝法。(3)蛋白印迹分析：应用AQP4多克隆抗体。取脑组织蛋白质样品进行变性SDS/12.0%聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳,然后用石墨半干法电转移于聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,应用TBS-T(pH=7.5)缓冲液配制5%无脂牛奶,室温温育90min,封闭PVDF膜,TBS-T缓冲液漂洗,PVDF膜与AQP4多克隆抗体(1:500稀释)4℃下孵育过夜,然后再与辣根过氧化物酶标IgG二抗室温温育1h,每次10min;最后用ECL方法显影,并用图像分析仪测定条带的吸光度。

　　1.3 数据处理 结果以均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS13.0统计软件进行统计学处理包括方差齐性检验、方差分析及q检验等。

　　2 结 果

　　2.1 脑含水量变化

　　脑出血组脑含水量6h即开始增加，3d达到高峰后缓慢下降，7d仍高于正(P<0.05);依达拉奉组达到高峰时间与脑出血组相同，但各时间点脑含水量低于脑出血组(P<0.05，见表1)。

　　2.2 脑组织EB含量变化

　　脑出血后6h脑组织EB含量开始升高，1d～3d时最高，之后逐渐降低;依达拉奉组的变化与脑出血组相似，但各时间点EB含量低于脑出血组(P<0.05，见表2)。

　　2.3 脑组织AQP4表达变化

　　脑出血后6h脑组织AQP4表达即已升高，3d达到高峰，7d仍高于正常;依达拉奉组各时间点AQP4表达低于脑出血组(P<0.05，见表3)。

　　脑含水量、EB含量与AQP4表达的相关分析

　　脑出血后脑含水量、EB含量与AQP4表达的变化规律一致，相关分析显示脑含水量与AQP4表达正相关(r=0.977，P<0.05);EB含量与AQP4表达也呈正相关(r=0.585,P<0.05)。

　　表1 脑出血后不同时间点脑含水量(注：与对照组比较*P<0.05;与脑出血组比较△P<0.05

　　表2 脑出血后不同时间点脑组织EB含量注：与对照组比较*P<0.05;与脑出血组比较△P<0.05

　　表3 脑出血后不同时间点脑组织AQP4含量注：与对照组比较*P<0.05;与脑出血组比较△P<0.05

　　3 讨 论

　　脑出血后脑水肿是导致病情恶化及影响临床预后的关键因素。大量研究证实，脑出血后脑水肿形成与自由基氧化损伤有着密切的关系[4];AQP4是脑内表达最多的AQP亚型,主要在星型胶质细胞和室管膜细胞内表达[5]，尤其在与毛细血管和软脑膜直接接触的胶质细胞上及血管周表达丰富[6]，是胶质细胞与脑脊液以及血管之间的水调节和运输的重要结构基础。与脑脊液重吸收、渗透压调节、脑水肿形成等生理、病理过程密切相关。

　　本实验发现脑含水量在脑出血后6 h开始升高，3 d达到高峰，之后开始下降，7 d仍然高于正常，与AQP4表达的变化一致，二者呈显著正相关(r=0.977，P<0.05)，此结果与李燕华等[7]的文献报道一致。脑出血组AQP4表达水平和脑含水量在相应时间点上均高于对照组，提示AQP4表达的上调导致脑含水量的增加。说明AQP4与脑出血后脑水肿的形成有密切关系。

　　脑出血组脑组织EB含量在脑出血后6 h出现上升，1～3 d时间段达到高峰后缓慢下降，AQP4的表达于脑出血后6 h开始升高，3 d达到高峰后缓慢下降，7 d仍高于正常水平。BBB通透性与AQP4表达的相关分析显示二者呈显著正相关，表明脑出血后BBB的破坏可能引起AQP4表达的上调，促使水相通道的开放增加。

　　依达拉奉是日本新开发的一种新型自由基清除剂在体内以阴离子形式存在，可转移一个电子给自由基而产生依达拉奉基团并且打断脂质过氧化反应链进而保护神经细胞。本实验中，依达拉奉组与脑出血组相比，BBB通透性高峰出现的时间趋于一致，但峰值明显降低，其它时间点脑组织内EB含量也低于脑出血组，表明依达拉奉能降低BBB的通透性。依达拉奉组AQP4表达及脑含水量在各时间点值均低于脑出血组，说明依达拉奉能够降低脑出血后脑内AQP4的表达及脑含水量。在脑水肿早期，自由基上调AQP4的机制可能与自由基与其受体结合后激活细胞膜内侧的第二信使系统，引起蛋白激酶C活性升高和细胞内Ca2+释放，进而对AQP4上蛋白激酶C和钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II磷酸化位点进行磷酸化，从而促进AQP4的表达[8]。在脑水肿中晚期,BBB破坏是AQP4表达上调的主要有效诱导因素[9]，自由基可以激活蛋白酶、磷脂酶引起细胞膜和毛细血管的脂质过氧化，从而破坏血脑屏障,使AQP4表达上调。

　　总之,通过本实验证实依达拉奉通过与自由基特异性结合，可以减轻自由基对BBB的破坏,降低BBB通透性,同时抑制AQP4的表达;以减轻脑水肿。提示我们可以通过抑制自由基的活性，并在调控AQP4表达等方面对脑水肿进行预防及治疗。

　　【参考文献】

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　　[2] 程晓燕，王红云，安沂华.自体血脑内注射建立大鼠脑出血模型实验研究[J].中国康复理论与实践，2004，10(6)：346-347.

　　[3] Belayer L，Busto R，Zhao W，et a1.Ginsberg，Quantitative evaluation of blood—brain barrier permeabilityfollowing midlle cerebralartery occlusion in rats[J].Brain Research，1996，739(1)：88-96.

　　[4] 昊碧华，昊文斌，胡常棘.自由基与中枢神经系统疾病[J] .川北医学院学报，2001,4(1):45-53

　　[5] Venero，Vizuete ML，Machado A，et a1.Aquaporins in the central nervous system [J].Prog Neurobiol，2001，63(3)：121-130.

　　[6] 石向群，杨金开，包仕尧，等.水通道蛋白4在正常大鼠脑内分布的研究[J].中华神经医学杂志，2004，13(4)：257-259.

　　[7] 李燕华，孙善全.实验性脑出血后水通道蛋白4的表达变化[J].中华神经科杂志，2004，37(2)：144-148.

　　[8] Zelenina M，Zelenin S，Bondar AA，et a1.Water permeability of aquoporin-4 is decreased by protein kinase C and dopamine[J].Am J Physiol Renal Physiol，2002，283：F309-318.

　　[9] 周仁兰，谢鹏.脑内水通道蛋白4与脑水肿的机制[J].中国急救医学,2OO4,(8):594-595.