垂体腺苷环化酶激活肽对大鼠创伤性脑损伤的保护作用

　　【摘要】 目的 观察损伤后给予不同剂量的垂体腺苷环化酶激活肽(PACAP)对大鼠脑创伤引起的神经凋亡等继发性损伤的影响。方法 采用创伤性脑损伤(TBI)模型，侧脑室注射PACAP，观察脑组织含水量,丙二醛(MDA)含量,超氧化物歧化酶(SOD)活性，流式细胞术(FCM)检测神经细胞凋亡。结果 与对照组相比，PACAP治疗组减轻脑水肿，降低MDA含量，提高SOD活性，降低神经细胞凋亡的比例。不同剂量PACAP治疗组的结果有差异。结论 PACAP对大鼠脑创伤后的继发性损伤具有保护作用。

　　【关键词】 垂体腺苷环化酶激活肽 创伤性脑损伤 丙二醛 超氧化物歧化酶 脑含水量 凋亡

　　The Protective Effect of Pituitary Adenylate Cyclase Activating Peptide

　　after Traumatic Brain Injury in RatsWANG Bao-xu，QIU Jian-wu，DUAN Ying-jie

　　(Department of Neurosurgey, the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University, Jinzhou 121001 China)【Abstract】 Objective To study the protective effect of different dose of PACAP after the secondary lesion such as neuron apoptosis following traumatic brain injury in rats. Methods With the modal of TBI, the PACAP was injected into lateral cerebral ventricle to observe moisture of rat brain, content of MDA and activity of SOD. Flow cytometry was adopted to examine neuron apoptosis. Results PACAP can lessen cerebral edema, degrade content of MDA, elevate activity of SOD, degrade proportion of neuron apoptosis. The result of different dose of PACAP was differential. Conclusions PACAP can relieve the secondary lesion following traumatic brain injury in rats.

　　【Key words】 Pituitary Adenylate Cyclase Activating Peptide; traumatic brain injury; MDA; SOD; cerebral moisture capacity; apoptosis

　　垂体腺苷酸环化酶激活肽(pituitary adenylate cyclase activating peptide，PACAP)是一种与组织代谢、细胞分化、增殖等有关的具有广泛生物活性的神经肽，是血管活性肠肽(VIP)—胰高血糖素—生长激素释放激素(GHRH)—促胰液素家族中的一新成员[1]。创伤性脑损伤(traumatic brain injury，TBI)后一系列的继发性损害会进一步加重病人脑损害的程度。防治TBI后的继发性损害，是提高病人愈后生命质量的重要治疗手段。体外研究结果表明PACAP能保护培养的神经元免受某些物质的神经毒作用[2]。但是，PACAP在TBI后的具体作用机制不明确。本研究是以大鼠作为TBI模型，探讨TBI后继发性脑损伤的机制及PACAP对TBI后继发性脑损伤的影响，为PACAP治疗TBI后继发性脑损伤的新思路提供理论依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 试验动物

　　成年健康雄性SD大鼠48只，体重250～300g，由辽宁医学院试验动物中心提供。

　　1.1.2 试验试剂

　　PACAP(武汉博士德公司)，超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)测试盒(南京建成生物工程研究所)，Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(北京博奥森公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 分组 SD大鼠随机抽样分为6组，假手术组，生理盐水组和PACAP(5μg,0.5μg，0.05μg,0.005μg)组分别于致伤后30min给予侧脑室注射5μL液体。

　　1.2.2 动物模型制备

　　参照 Feeneys自由落体撞击伤方法。SD大鼠称重后经10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.3mL/100g)，俯卧固定于脑立体定位仪上。矢状中线切开头皮后分离骨膜，暴露前囟、冠状缝和矢状缝及顶骨。以前囟后3.0mm,向右旁开矢状缝3.0mm为中心作一直径约为4～5mm颅骨钻孔。保持硬脑膜完整。将自由落体装置底座置于右顶骨窗部的硬脑膜表面，以25g重物自40cm高沿套管下落打击致伤底座，其直径3.5mm,最大下陷距离3.0mm。造成右顶局限性损伤。假手术对照组动物仅作头皮切口，开颅骨窗不致脑损伤。用牙托粉封闭骨窗，缝合头皮，置鼠笼喂养。

　　1.2.3 侧脑室注射方法

　　参照大鼠脑立体定位图谱，定位于囟后1.0mm，中线旁开1.5mm，颅骨骨膜下3.0 mm，药物经微量进样器通过钢管注入侧脑室内，PACAP38肽溶解在生理盐水内，于损伤后0.5h给药，给药量为5μL[3]。注射速度为1μL/min，于5min内注射完毕。

　　1.2.4 标本取材

　　大鼠外伤性颅脑损伤72h后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.3mL/100g),断头处死，在冰盘上快速取全脑，0℃ PBS缓冲液清洗，滤纸吸干。于伤灶周围取约100mg脑组织，用干湿重法测脑含水量;于伤灶周围取约50mg脑组织，制单细胞悬液，FCM检测调亡;于伤灶周围取150mg脑组织，制脑组织匀浆，用于测SOD活性和MDA含量。

　　1.2.5 脑组织含水量的测定

　　用Eliot公式计算脑含水百分率：脑含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%。将脑组织放入预先已称重的玻璃杯中，用电子分析天平称量湿重后置入110℃恒温干燥箱内，24h后取出后再次称重。

　　1.2.6 制脑组织匀浆及SOD和MDA的测定

　　脑组织用生理盐水冲洗血液，滤纸吸干水分，分离大脑皮层，低温下称重后置于玻璃匀浆管中，然后加入2mL生理盐水中用超声波细胞粉碎机制成10%的脑组织匀浆，4℃下4 000r/min离心10min，取上清液，用于测SOD和MDA的样本。

　　1.2.7 制单细胞悬液及FCM检测凋亡

　　取脑组织约50mg，放入0℃ PBS缓冲液约5mL，用眼科剪将脑组织剪成为0.1 mm3左右组织碎片，5mL移液器吹打15次，180目滤网0℃ PBS冲洗过滤，收集滤液，300目滤网再次0℃ PBS冲洗过滤，收集滤液。滤液用0℃ PBS稀释至10mL，1 000r/min离心5min，弃上清。0℃ PBS清洗2次(重悬至10mL) 1 000r/min离心5min，弃上清。细胞计数后，按FCM操作步骤及Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明，检测细胞凋亡。

　　1.2.8 统计学处理

　　所有数据均以均数±标准差表示。以SPSS 11.5统计软件进行统计分析，组间比较采用F检验及q检验。P<0.05代表差异有显著性。

　　2 试验结果

　　2.1 PACAP对脑含水量的影响

　　侧脑室分别给予5、0.5及0.05μg的PACAP均能使脑组织含水量减少，与侧脑室给予生理盐水组相比，差异有显著性(P<0.05)，0.005μg PACAP虽然可使脑组织含水量降低，但是与生理盐水组相比，差异无显著性(P>0.05,表1)。

　　2.2 PACAP对TBI后脑组织内SOD和MDA表达的影响

　　侧脑室分别给予5μg、0.5μg及0.05μg的PACAP均能使脑组织SOD活性提高和MDA含量降低，与侧脑室给予生理盐水组相比，差异有显著性(P<0.05),0.005μg PACAP组脑组织SOD活性提高和MDA含量降低，但是与生理盐水组相比，差异无显著性(P>0.05,表1)。表1 脑组织含水量、SOD活性及MDA含量变化注：#P<0.05 ﹠假手术组;* P<0.05 ﹠生理盐水组;

　　** P>0.05 ﹠生理盐水组

　　2.3 PACAP对TBI后神经细胞凋亡的影响

　　FCM检测神经细胞凋亡显示生理盐水组神经细胞凋亡率明显高于假手术组(P<0.05);PACAP(5μg、0.5μg及0.05μg)组神经细胞凋亡率明显低于生理盐水组(P<0.05); PACAP(0.005μg)组与生理盐水组比较，凋亡率的差异不显著(P>0.05)，(图1，表2)。图1 流式细胞仪检测凋亡图谱表2 PACAP对TBI后神经细胞凋亡率的影响注：#P<0.05 ﹠假手术组;*P<0.05 ﹠生理盐水组;

　　3 讨 论

　　当颅脑损伤发生时，除了创伤当时直接造成的神经损伤外，外伤后脑内还出现继发性的神经损伤，而神经细胞凋亡是外伤性颅脑损伤后继发性神经损伤的重要机制。1993年，Tominaga等首次证实缺血性脑损伤可引起神经细胞凋亡[4]; Rink等于1995年发现，外伤性颅脑损伤后伤侧皮质、海马及齿状回等区域出现神经细胞凋亡[5]。脑创伤后Ca2+超载、氧自由基的产生、兴奋性氨基酸的过度释放可以诱发神经细胞凋亡。通过某种途径减轻或逆转病理状态下神经细胞凋亡过程，是减轻脑创伤后继发性脑损伤的重要方法。

　　PACAP是促胰液素、高血糖素、血管紧张素家族中的一个多肽。它在神经系统中广泛分布，具有多种功能。日前PACAP的神经营养和神经保护作用越来越引起人们的注意。而且，PACAP为小分子多肽，能够完整的通过血脑屏[6]。并且在体外原代培养的小脑颗粒细胞培养液中，PACAP可抑制程序性细胞死亡，还能诱导细胞突起生长[7]。PACAP对交感、感觉神经元也起到营养和保护作用，能调节神经肌接头的电活动。因此，PACAP有可能作为防治脑创伤后继发性脑损伤的新药物。

　　本试验结果显示PACAP治疗组显著提高SOD的活性(P<0.05),同时显著降低MDA的含量(P<0.05),提示PACAP具有自由基清除样作用，能够提高机体的抗氧化能力，减少脑创伤时大量自由基的生成和阻断其连锁反应。

　　本研究采用流式细胞分析法计数创伤灶附近的脑组织细胞死亡和凋亡情况。结果显示PACAP治疗组能够显著较少细胞凋亡，提示有保护创伤性脑损伤的作用。推测其机制可能与以下有关：(1)PACAP能提高脑抗氧化酶的活性，抑制氧化应激反应，减少氧自由基的危害作用;(2)通过特异性受体使神经细胞内的游离钙离子减少;(3)PACAP也可以通过环磷酸腺苷(cAMP)直接调控N-甲基-D-天(门)冬氨酸(NMDA)受体，保护神经元免受谷氨酸的毒性作用[8]。但其具体有关机制尚待进一步研究。

　　实验结果显示PACAP治疗组能够显著降低脑含水量，说明其有减轻脑水肿的作用。其作用机制可能为PACAP减轻神经细胞凋亡，减少细胞继发性损伤，从而减少各种细胞因子，氧自由基的释放[9]，从而减轻脑水肿。除此之外的其它相关机制还有待进一步研究。

　　因此，我们认为脑创伤后早期应用适量的PACAP能够减少神经细胞凋亡，减轻脑水肿，可以有效的防治脑创伤的一系列继发性损伤。

　　【参考文献】

　　[1] Vaudry D，Gonzalez BJ，Basille M，et al.Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide and its receptors: from structure to functions[J]. Pharmacol Rev JT，2000,52(2):269-324.

　　[2] Arimura A，Somogyvari-Vigh A，Weill C，et al.PACAP functions as a neurotrophic factor[J]. Ann N Y Acad Sci JT，1994,739:228-243.

　　[3] Tamas A，Zsombok A，Farkas O，et al.Postinjury administration of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) attenuates traumatically induced axonal injury in rats[J]. J Neurotrauma JT，2006,23(5):686-695.

　　[4] Tominaga T，Kure S，Narisawa K，et al.Endonuclease activation following focal ischemic injury in the rat brain[J]. Brain Res JT，1993,608(1):21-26.

　　[5] Rink A，Fung KM，Trojanowski JQ，et al.Evidence of apoptotic cell death after experimental traumatic brain injury in the rat[J]. Am J Pathol JT，1995,147(6):1575-1583.

　　[6] Marks SJ，Batra RR，Frishman WH.Estrogen replacement therapy for cognitive benefits: viable treatment or forgettable “senior moment”?[J]. Heart Dis JT，2002,4(1):26-32.

　　[7] Fillit HM.The role of hormone replacement therapy in the prevention of Alzheimer disease[J]. Arch Intern Med JT，2002,162(17):1934-1942.

　　[8] Waschek JA.Multiple actions of pituitary adenylyl cyclase activating peptide in nervous system development and regeneration[J]. Dev Neurosci JT，2002,24(1):14-23.

　　[9] Fink KB，Andrews LJ，Butler WE，et al.Reduction of post-traumatic brain injury and free radical production by inhibition of the caspase-1 cascade[J]. Neuroscience JT，1999,94(4):1213-1218.