下咽癌中hMLH1和hMSH2蛋白的低表达及临床意义

　　【摘要】 目的探讨下咽癌和正常喉组织中hMLH1和hMSH2蛋白的表达和临床意义。方法 采用免疫组化法检测下咽癌和正常喉组织中hMLH1和hMSH2蛋白的表达。结果 在下咽癌中hMLH1和hMSH2蛋白的阳性率为54%、56%，显著低于正常喉组织中的80%、85%，差异具有统计学意义(P<0.05)。hMLH1和hMSH2的表达与下咽癌的分化程度和淋巴结转移有关(P<0.05)，与T分期无明显相关性。结论 hMLH1和hMSH2在下咽癌早期发生及发展中起重要作用，hMLH1和hMSH2的表达与下咽癌的分化程度及预后有关。

　　【关键词】 下咽癌;正常喉组织;hMLH1;hMSH2;免疫组织化学

　　hMLH1 and hMSH2 Protein in Hypopharyngeal Carcinoma LowExpression and Its Clinical Significance

　　GUO Miao,ZHANG Chao,LU Eryong,et al

　　(First Affiliated Hospital,Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003,China)

　　Abstract:ObjectiveTo explore the relationship between the expression of hMLH1，hMSH2 and its clinical significance in hypopharyngeal carcinoma and normal laryngeal tissue.Methods The expression of hMLH1 and hMSH2 protein were detected by immunohistochemistry SP method in 50 cases of hypopharyngeal carcinoma and 20 cases of normal laryngeal tissue.Results The expression rates of hMLH1 and hMSH2 in hypopharyngeal carcinoma were 54%，56%，lower than the rates in normal laryngeal tissue 80%，85%, and the statistics comparison between the two groups showed different significance(P<0.05).The expression of hMLH1 and hMSH2 was related to differentiation level and metastasis of lymphonode of hypopharyngeal carcinoma(P<0.05)，and there was no significant correlation with T stage.Conclusion hMLH1 and hMSH2 play important roles in the early occurrence and development of hypopharyngeal carcinoma.The expressions of hMLH1 and hMSH2 are related to hypopharyngeal carcinoma differential degree and prognosis.

　　Key words:hypopharyngeal carcinoma;normal laryngeal tissue;hMLH1;hMSH2;immunohistochemistry

　　hMLH1与hMSH2是人类错配修复基因(humane mismatch repair gene,hMMR)家族中非常重要的两个基因，维持着DNA复制的高保真性及起着控制基因突变的作用，它们的功能缺陷被认为是肿瘤发病的重要机制之一，并成为近年来研究的热点。有研究表明，hMMR与食管癌、胃癌、宫颈癌等肿瘤[1]关系密切，但在下咽癌中的表达状况国内尚未见报道。本实验通过免疫组化方法检测下咽癌和正常喉组织中的hMLH1和hMSH2蛋白的表达状况，探讨它与下咽癌临床病理特征的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料来源 下咽癌包括梨状窝癌、环后癌、咽后壁癌，因后两种类型较少见，且以放化疗为主，故本研究主要讨论梨状窝癌。所检测组织选自河南科技大学第一附属医院2008～2010年耳鼻喉科、头颈外科手术切除存档的下咽癌石蜡标本50例，标本均为第1次住院的原发下咽癌(梨状窝癌)，术前未进行放疗和化疗;另选正常喉组织20例作对照。50例下咽癌病例中，T1期16例，T2期24例，T3期10例，T4期0例;高分化鳞癌25例，中分化鳞癌15例，低分化鳞癌10例;有淋巴结转移12例，无淋巴结转移38例。

　　1.2 试剂 鼠抗人MLH1、MSH2单克隆抗体试剂，广谱SP试剂盒，PBS磷酸盐缓冲液等，均采购于北京中杉金桥生物技术公司。

　　1.3 实验方法 采用免疫组化SP法，试验中染色过程按照北京中杉金桥生物技术公司提供的SP试剂盒说明书进行。用北京中杉金桥生物技术公司提供的阳性照片作阳性对照，以PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。

　　1.4 结果判定 hMLH1、hMSH2蛋白表达主要位于细胞核和(或)胞浆，胞核和(或)胞浆有棕黄色颗粒为阳性细胞。每张切片随机观察5个高倍视野，每个视野记数100个细胞，阳性细胞数<10%为阴性片，阳性细胞数>10%为阳性片。

　　1.5 统计学处理 实验所得数据均采用SPSS12.0统计软件进行处理，采用2检验分析结果，P<0.05为差异具有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 50例下咽癌、20例正常喉组织中hMLH1、hMSH2蛋白阳性率分布 见表1，两组hMLH1蛋白表达差异比较χ2=4.076，P<0.05，hMSH2蛋白表达差异比较χ2=5.23，P<0.05。hMLH1、hMSH2蛋白在两种组织中的阳性表达差异有统计学意义(P<0.05)。表1 hMLH1和hMSH2蛋白在下咽癌和正常喉组织中的表达

　　2.2 hMLH1、hMSH2蛋白的表达与下咽癌临床病理特征的关系 hMLH1、hMSH2蛋白在下咽癌T分期组间的表达差异无统计学意义(P>0.05)，但在不同分化程度、淋巴结转移组间表达差异具有统计学意义(P<0.05)，见表2。表2 hMLH1、hMSH2蛋白的表达与下咽癌临床病理特征的关系

　　3 讨论

　　下咽癌的发病机制与其他系统肿瘤的发病机制相似，都与分子水平的基因突变有关，人体细胞中的DNA错配修复反应过程依赖于几种人类错配修复基因产物的参与。迄今为止，已经发现9个错配修复基因[2]，分别是hMSH2、hMSH6、hMSH5、hMSH4、hMSH3、hMLH1、hPMS1、hPMS2、hMLH3。hMLH1、hMSH2是其中较为重要的两种，若其中任何一种基因发生突变导致其产物功能的丧失都将会造成DNA 错配修复功能的异常、缺陷或者丧失。DNA 错配修复功能的异常、缺陷或丧失将会出现微卫星的不稳定性或复制错误阳性，使整个基因组不稳定性增加，从而引起包括癌基因和抑癌基因的一系列改变，发生各种肿瘤[3]。研究证明HMMR功能异常与呼吸、消化道和泌尿系统肿瘤的发病有密切关系。

　　本研究发现，hMLH1和hMSH2在下咽癌中表达阳性率明显低于在正常喉组织中的表达阳性率，在下咽癌中hMLH1和hMSH2蛋白阳性表达率分别为 54%和56%，在正常喉组织中的阳性表达率为80%和85%。由此可以认为，这两种蛋白的表达在正常喉组织和癌组织由高到低的变化，可能是下咽癌的发生、发展过程中的一个重要事件，其中表达量下调可能助长了细胞的异常增殖活动，促进肿瘤的发生。这两个蛋白在癌组织中的表达各家报道不一，唐郡等采用免疫组化的方法检测144例食管鳞癌手术切除标本、30例正常黏膜组织中hMSH2和hMLH1表达情况，并与临床病理参数作相关分析，结果食管鳞癌组织hMLH1和 hMSH2基因阳性表达明显下降，与正常食道黏膜相比相差显著(P<0.01)。hMLH1和hMSH2表达缺失与年龄、性别、肿瘤大小、浸润深度无明显相关，与肿瘤的分化程度和淋巴结转移有关(P<0.01)[4]。以上研究均表明多种恶性肿瘤的发生都伴随着错配修复蛋白结构或功能的异常，常表现为hMLH1和(或) hMSH2蛋白表达的减少。但也有研究发现相反的结论，范凯[5]等研究结果显示，hMSH2蛋白在胃癌中的阳性表达率40%，较正常胃组织中高，董莉[6]等研究发现hMSH2蛋白在子宫内膜癌中高表达，出现此现象的原因可能是在一些致癌因素长期反复的刺激下，某些增殖活跃的细胞会出现基因的多点突变以及DNA复制上的错误，导致hMSH2蛋白代偿性的表达上调。

　　本研究还发现，hMLH1和hMSH2两种蛋白在临床分期中的表达差异无统计学意义，而在高分化、中分化到低分化下咽癌中两种蛋白的阳性表达率有显著下降。对于恶性肿瘤来说，分化程度是肿瘤的恶性程度及预后的重要指标之一，因此检测hMLH1 和hMSH2两种蛋白对于下咽癌的预后有非常重要的意义。另外在有淋巴结转移的下咽癌病例中，hMLH1和hMSH2两种蛋白的阳性表达率显著低于没有发生淋巴结转移的病例，由此认为hMLH1和hMSH2蛋白与下咽癌的淋巴结转移有关，在下咽癌的发展过程中持续作用。本实验研究结果与大多数研究结果类似[4，7]。

　　综上所述，hMLH1和hMSH2蛋白在下咽癌中的表达下调，可能在下咽癌早期发生中起着重要的作用，并且这两种蛋白的表达程度很可能与下咽癌的发展及预后有密切关系。因此，联合检测hMLH1和hMSH2基因蛋白将在下咽癌早期的预警、诊断及其预后评估中产生重要的临床意义，并可能成为基因治疗新的靶点。

　　【参考文献】

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　　[3] Wijnen JT,Vasen HF,Khan PM,et al.Clinical findings with implications for genetic testing in families with clustering of colorectal cancer[J].N Engl J Med,1998, 339(22): 511-518.

　　[4] 唐郡,阎晓初,彭贵勇，等.食管鳞状细胞癌组织中hMLH1、hMSH2表达及意义[J].现代生物学进展,2007,7(11):1687-1689.

　　[5] 范凯，马坚妹，王朝晖，等.胃癌中hMSH2,PTEN和PCNA表达的相关性及意义[J].解剖学杂志，2006，29(1):58-60.

　　[6] 董莉,王文革,王莉,等.错配修复基因hMLH1,hMSH2及p53在子宫内膜癌中的表达及意义[J],实用药物与临床,2007,10(2):71-73.

　　[7] 谷建琦，张英怀，董青，等.hMLH1,hMSH2蛋白在口腔鳞状细胞癌中的表达及意义[J].北京口腔医学，2007，15(2)：87-90