RhoA、Ki-67的过表达促进胃癌的浸润转移

　　【摘要】 目的：探讨RhoA和Ki-67表达变化与胃癌浸润转移的关系及二者在胃癌浸润转移过程中的相关性。方法：运用SABC免疫组化技术，检测RhoA和Ki-67在46例原发性胃癌中的表达。结果：随着胃癌浸润深度的加深、分化程度的降低、淋巴结转移的发生，RhoA和Ki-67的阳性表达率逐渐增高;二者在胃癌组织中的表达呈正相关。结论：RhoA、Ki-67过表达促进胃癌的浸润转移，二者在胃癌的浸润转移中相互关联，共同作用。

　　【关键词】 胃癌;RhoA;Ki-67;浸润转移;免疫组化

　　Acceleration of invasion and metastasis of gastric cancer by RhoA and Ki-67 overexpression

　　SUN Yuqing,XIONG Jianxin,LIU Yan，ZHU Yanli

　　(Jiamusi University,Jiamusi 154003,China)

　　Abstract：Objective：To explore the relationship between the changes of RhoA and Ki-67 expression and the invasion and metastasis in gastric cancer and the correlation of RhoA and Ki-67 in the progress of invasion and metastasis in gastric cancer.Methods：The expression of RhoA and Ki-67 was detected by using SABC immunohistochemical method in 46 cases of primary gastric cancer.Results：The positive expression rates of RhoA and Ki-67 increased with increase in the depth of infiltration,decrease in the degree of differentiation and the development in lymphatic metastasis. The expression of RhoA and Ki-67 in gastric cancer tissue showed a positive correlation.Conclusion：The overexpression of RhoA and Ki-67 may accelerate the invasion and metastasis in gastric cancer, and the two are correlated and acted with each other in the invasion and metastasis in gastric cancer.

　　Key words:gastric cancer; RhoA; Ki-67; invasion and metastasis; immunohistochemistry

　　胃癌(gastriccarcinoma GC)是最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人类的健康，根据全国肿瘤防治办公室杨玲博士2006年发表在《世界胃肠病学杂志》中的文章的估计，目前中国每年新发胃癌患者达40万人，死亡人数达30万人，已超过世界平均水平的两倍。众多研究表明，肿瘤的侵袭和转移是胃癌恶性特征和标志，也是导致胃癌患者治疗失败的主要原因及治愈率得不到提高的主要影响因素。目前认为，侵袭和转移是一个多因素参与的多种环节的复杂过程。其中包括无数致癌因子的协同作用，深入探讨它们在胃癌中各自的作用机制及相互之间的联系，将对进一步阐明和阻断肿瘤的转移具有重要价值。RhoA为Ras同源类似物A(RashomologyA)属于Rho家族蛋白的Rho亚家族成员，与Ras蛋白一样，是重要的细胞内信号分子，可通过多种信号途径参与调节细胞的生长、凋亡和细胞周期[1]。Ki-67(Nuclear-associatedantigen)是与细胞增殖相关的核抗原，只在增殖细胞G1、S、G2和M期表达，而G0期不表达,并且在S期后期开始升高，在G2、M期达到高峰[2，3]。有人认为，Ki-67的功能与有丝分裂密切相关，在细胞增殖中不可缺少。二者在胃癌组织中的表达变化与胃癌细胞增殖能力及浸润转移的关系尚少见报道。本文采用SABC免疫组化技术，观察46例原发性胃癌中RhoA和Ki-67表达变化，探讨二者在胃癌浸润、淋巴结转移中的作用及相关性。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料

　　选取佳木斯大学附属第一医院2002～2008年间手术切除且资料完整的胃癌46例。所有患者术前未经放疗和化疗。其中男26例，女20例;年龄34～81岁，平均53岁;肿瘤大小：≤5cm32例，>5cm14例;肿瘤分化：高分化14例，中、低分化32例;侵及浆膜及浆膜以外者19例，未及浆膜者27例;有淋巴结转移28例，未见淋巴结转移18例。

　　1.2 方法

　　新鲜标本常规福尔马林固定，24h内取材，石蜡包埋，连续4μm厚度切片，HE染色。免疫组化染色：采用SABC免疫组化技术，RhoA和Ki-67单克隆抗体(即用型)及SABC免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，操作严格按说明书进行。用已知阳性片作阳性对照，同时用PBS替代第一抗体作阴性对照。

　　1.3 结果判断

　　两位病理医师独立观察每张切片10个具有代表性的高倍视野。RhoA和Ki-67阳性判断标准：前者阳性染色者在细胞膜或(和)浆有棕黄色颗粒沉着;后者阳性染色者在细胞核有棕黄色颗粒沉着。根据肿瘤细胞染色程度以及染色细胞百分率进行分析评分：无染色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。着色细胞占计数细胞百分率0～10%为0分，11%～24%为1分，25%～49%为2分，50%～74%为3分，≥75%为4分。两者相加为最终免疫组化结果：0～1分为阴性，2～3分为弱阳性(+)，4～5分为阳性(++)，6～7分为强阳性(+++)。

　　1.4 统计学处理

　　所得半定量资料用χ2检验。

　　2 结果

　　见表1。表1 RhoA和Ki-67在胃癌组织中的表达情况与临床病理特征的关系(略)

　　2.1 RhoA表达与胃癌临床病理学特征的关系

　　46例胃癌组织中，29例RhoA蛋白表达阳性(63.04%);其表达与胃癌患者的性别、年龄、原发肿瘤大小无明显相关(P>0.05);但是随浸润深度的加深、分化程度的降低、淋巴结转移的发生，其阳性表达率明显升高;其中未侵及浆膜组与侵及浆膜组的RhoA蛋白阳性表达率分别为48.15%(13/27)和84.21%(16/19)，差异显著，有统计学意义(P<0.05);高分化组与中-低分化组RhoA蛋白阳性表达率分别为28.57%(4/14)和78.13%(25/32)，差异显著，有统计学意义(P<0.05);淋巴结转移组与无淋巴结转移组的RhoA蛋白阳性表达率分别为78.57%(22/28)和38.89%(7/18)，差异显著，有统计学意义(P<0.05)。

　　2.2 Ki-67表达与胃癌临床病理学特征的关系

　　Ki-67蛋白的阳性表达率随浸润深度的加深、分化程度的降低、淋巴结转移的发生而升高(P<0.05)，而与患者性别、年龄、肿瘤的原发部位及肿瘤的大小无明显相关(P>0.05)。本组46例胃癌组织中Ki-67阳性表达者共34例，其中未侵及浆膜组与侵及浆膜组的Ki-67蛋白阳性表达率分别为59.26%(16/27)和94.74%(18/19)，差异显著，有统计学意义(P<0.05);高分化组与中-低分化组Ki-67蛋白阳性表达率分别为50.00%(7/14)和84.38%(27/32)，差异显著，有统计学意义(P<0.05);淋巴结转移组与无淋巴结转移组的Ki-67蛋白阳性表达率分别为89.29%(25/28)和50.00%(9/18)，差异显著，有统计学意义(P<0.05)。

　　2.3 胃癌组织中RhoA和Ki-67表达情况与胃癌浸润、转移

　　胃癌组织中RhoA和Ki-67表达呈正相关(rs=0.468,P<0.05),即随浸润深度的加深、分化程度的降低、淋巴结转移的发生二者均呈增高趋势，见表3。表3 RhoA与Ki-67在胃癌中表达的相互关系(略)

　　3 讨论

　　本研究应用免疫组化方法观察RhoA和Ki-67在胃癌组织中的表达变化，结果表明，RhoA和Ki-67过表达均与胃癌浸润及淋巴结转移呈正相关，二者在胃癌浸润转移过程中相互关联，共同作用。RhoA蛋白属于Rho亚家族蛋白成员，具有GTP酶活性，是一种肿瘤调节相关蛋白[4]。其表达与肿瘤的恶性程度及患者的预后密切相关。RhoA在结肠癌细胞中的表达增高，且与肿瘤的侵袭能力成正相关。研究发现，RhoA蛋白可通过调节细胞骨架、调节细胞增生、调节细胞转录等[5，6]作用调控恶性肿瘤细胞的浸润和转移等多种生物学行为，因此，RhoA蛋白是一种与肿瘤侵袭转移相关的蛋白。本研究发现随浸润深度的加深、分化程度的降低、淋巴结转移的发生，RhoA的表达也随之明显升高。Ki-67的表达与肿瘤细胞的细胞周期密切相连，它在G1后期开始出现，在S期和G2期逐渐升高，M期达到高峰，有丝分裂结束后，迅速降解消失，G0期中无表达。与其他细胞周期相关蛋白不同的是，在DNA修复状态的细胞中不表达，而在有丝分裂中期，则呈网状包裹在浓缩的染色体周围[7，8]。总之，Ki-67蛋白的功能与细胞有分裂有关。关于其作用机制我们认为，它可能凭借一种自我调控的方式作用于细胞周期：一方面，其通过自身数个结构域的表达，从而减少自身转录以实现蛋白表达水平的自我调控;另一方面，其通过自身的磷酸化、去磷酸化支持核仁的崩解与形成(这种作用可直接促进细胞启动或退出有丝分裂期)，从而间接影响细胞周期。本研究结果显示，Ki-67与胃癌组织的浸润深度、分化程度及淋巴结转移密切相关，差异具有显著性。

　　恶性肿瘤的浸润转移是一个复杂的连续过程,在多数情况下，单一基因表达的变化常不足以影响细胞的正常生物活动而导致肿瘤的发生，往往需要几种基因协同作用，共同参与。不少学者提出多基因协同学说,认为在肿瘤发生发展和转移的各个阶段,至少有2个或2个以上功能不同的异常激活的癌基因各自发挥着不同的作用,并在时间上和空间上相互配合,协同促进了细胞的癌变和转移。而肿瘤细胞的异常增生是肿瘤侵袭的先决条件。本研究用免疫组化研究发现RhoA和Ki-67表达呈正相关，即RhoA可能通过某种或几种作用机制上调Ki-67的表达。综上所述,我们支持多基因协同学说,并认为两者协同作用共同促进胃癌的转移浸润。

　　【参考文献】

　　[1]Hill CS,Wynne J,Treisman R.The Rho family GTPases RhoA,Rac1,and CDC42Hs regulatetranscriptional activation by SRF[J].Cell，1995，81(7):11591170

　　[2]Bruno S,Darzynkiewicz Z.Cell cycle dependent expression and stability of the nuclear protein detected by Ki-67 antibody in HL-60 cells[J].Cell Prolif，1992，25(1):3140

　　[3]Yang P,Hirose T,Hasegawa T,et al.Prognostic implication of the P53 protein and Ki-67 antigen immunohistochemistry in malignant fibrous histiocytoma[J].Cancer，1995，76(4):618625

　　[4]Teramoto H,Malek RL,Behbahani B,et al.Identification of H-Ras,RhoA,Rac1 and Cdc42 responsive genes[J].Oncogene，2003，22(17):26892697

　　[5]Chappell J,Golovchenko I,Wall K,et al.Potentiation of Rho-A-mediated lysophosphatidic acid activity by hyperinsulinemia[J].J Biol Chem，2000，275(41):3179231797

　　[6]Fritz G,Brachetti C,Bahlmann F,et al.Rho GTPases in human breast tumours:expression and mutation analyses and correlation with clinical parameters[J].Br J Cancer，2002，87(6):635644

　　[7]Verheijen R,Kuijpers HJ,Schlingemann RO,et al.Ki-67 detects a nuclear matrix-associated proliferation-related antigen.I.Intracellular localization during interphase[J].J Cell Sci，1989，92:123130

　　[8]Verheijen R,Kuijpers HJ,van Driel R,et al.Ki-67 detects a nuclear matrix-associated proliferation-related antigen.Ⅱ.Localization in mitotic cells and association with chromosomes[J].J Cell Sci，1989，92(Pt4):531540