齿科合金活化线粒体途径诱导L929细胞凋亡的观察
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作者：李想，张宏伟，江清林 李想(1982～)女，黑龙江齐齐哈尔人，硕士，医师。 作者单位：1.东莞市妇幼保健院口腔科，广东 东莞 523001;2.佳木斯大学，黑龙江 佳木斯 154007 【摘要】 目的：探讨齿科合金通过线粒体途径诱导L929细胞凋亡的作用机制。方法：选用临床常用齿科合金和中科院金属研究所研发的三种低镍合金的浸提液处理小鼠L929细胞，用MTT法检测细胞增殖：用荧光染料罗丹明123检测细胞线粒体跨膜电位;Western-Blot检测线粒体凋亡通路相关蛋白的表达。结果：齿科合金作用L929细胞48h后，细胞线粒体跨膜电位降低，伴有细胞色素C从线粒体到胞浆的释放。结论：齿科合金通过活化线粒体信号转导途径引起线粒体跨膜电位下降与细胞色素C的释放可能是合金诱导L929细胞凋亡途径之一。 【关键词】 齿科合金;线粒体;凋亡;L929细胞 L929 apoptosis induced by dental alloy activation of mitochondrial signal transduction pathway LI Xiang，ZHANG Hongwei，JIANG Qinglin (1.Department of Stomatology, Dongguan Municipal Maternal and Child Care Hospital,Dongguan 523001,China; 2. Jiamusi University, Jiamusi 154007, China) Abstract：Objective：To explore the mechanism of L929 apoptosis induced by the dental alloy activation of mitochondrial signal transduction.Methods：The rat L929 cells were treated with dental low-nickel alloy extract. The cell proliferation was detected by MTT assay,the mitochondrial transmembrane potential was labeled by Rhodamine 123 and Western boltting was used to analyze the related protein expression of mitochondrial apoptosis signal transduction pathway.Results：After the L929 cells were treated by dental low-nickel alloy extract for 48h, the mitochondrial transmembrane potential was decreased and cytochrome C released from mitochondria to the cytoplasm.Conclusion：The dental alloy activation of mitochondrial signal transduction pathway causes the decrease in the mitochondrial transmembrane potential and the release of cytochrome C,which may be one of the ways of L929 apoptosis induced by dental alloy. Key words:：dental alloy; mitochondria apoptosis; cytochrome C; L929 cell 齿科合金已经广泛应用于口腔修复领域中，在口腔的复杂环境中，由于合金所析出的金属离子会对口腔细胞和组织形成不良刺激[1]，所以对齿科合金生物相容性的研究一直是国内外学者的关注热点之一。齿科金属材料作为一种生物材料，在与口腔组织相互接触中，口腔内唾液会对金属产生腐蚀作用，导致金属离子及其衍生物的析出，同时这些腐蚀物质的质和量又会对口腔组织产生各种作用，如细胞毒性，基因毒性等。本实验采用齿科合金的浸提液作用于小鼠L929细胞，从细胞分子水平上研究齿科合金诱导小鼠L929细胞凋亡时，线粒体膜电位及细胞色素C的变化，探讨金属材料诱导细胞凋亡的可能信号转导途径，为进一步揭示细胞凋亡的分子机制及从分子水平上评价材料的生物相容性提供充足的实验依据。 1 材料和方法 1.1 材料 小鼠L929成纤维细胞(中国医科大学附属口腔医院中心实验室);RPMI1640培养基(Hyclone公司，美国);标准胎牛血清(天津TBD);MTT(Sigma公司，美国);罗丹明123染色试剂盒(凯基生物科技发展有限公司，南京);细胞线粒体膜分离试剂盒、蛋白定量试剂盒(Pierce生物技术，美国);一抗鼠抗细胞色素C抗体(Boster公司，美国);辣根过氧化酶标记的羊抗鼠的二抗(北京中杉金桥);1号合金、2号合金、3号合金(中科院金属研究所研发，沈阳)和镍铬合金、金合金(Heraeus公司，德国)。 1.2 方法 1.2.1 材料试样和浸提液制备 所有合金材料按要求铸造成厚度0.1cm，半径0.5cm的圆片，打磨抛光，超声清洗15min，去离子水冲洗数遍。无菌条件下将3片同种试样浸在2mL的RPMI1640细胞培养液的瓶中，加盖后在(37±1)℃连续浸提7d后待用[2,3]。 1.2.2 细胞培养和加样培养 用含小牛血清和青、链霉素的RPMI1640培养小鼠L929细胞，置于37℃，5%CO2的培养箱中培养2～3d。用PBS(0.25%胰酶和0.04%EDTA)消化贴壁细胞，按1：4进行传代，继续培养48h。将材料浸提液分组，1号合金(A)、2号合金(B)、3号合金(C)、镍铬合金(D)、金合金(F)、阴性对照组(E)。细胞换去原培养液，继续培养48h后进行以下检测。 1.2.3 细胞毒性实验 收集对数生长期L929细胞，调整细胞密度为1×106，个/mL,以60μL/孔接种于96孔板，贴壁培养24h后，倒掉原培养液，分别加入各组合金浸提液，并设立阴性对照，继续培养48h后，用MTT法在波长为490nm测光密度值(OD值)，计算细胞增殖率P(P=各浸提液组OD均值/阴性对照组OD均值)。按毒性分级法评分：P～100时，0级;～80时，1级;～60时，2级;～40时，3级;～20时，4级。以上实验重复3次。 1.2.4 细胞线粒体跨膜电位检测 收集阴性对照组和实验组的L929细胞(3×106个),PBS清洗3遍，离心，重悬于罗丹明123染液中,37℃避光孵育30min后，以原培养液洗细胞2次，重悬细胞于Ep管中，罗丹明123为荧光指示剂，利用流式细胞仪(FACSStar)检测细胞线粒体跨膜电位的改变。实验重复3次取平均值进行统计分析。 1.2.5 Western-blot 收集各实验组L929细胞，按线粒体-胞质分离试剂盒操作分别收集胞浆上清和线粒体沉淀，考马斯亮蓝进行蛋白定量，取20μg变性样品经12%SDS-PAGE电泳，转膜，2%的脱脂奶粉稀释一抗(1:500)，4℃孵育过夜，封闭液洗膜2次;1%的脱脂奶粉稀释二抗(1：2000)，室温孵育1h，TBST洗膜4次，TBS洗2次。用DAB试剂盒进行显色，终止反应，用QuantityOneanalysissofeware测量条带灰度值，目的条带与-action条带灰度值比值即为此目的蛋白的相对表达量。实验重复3次取平均值进行统计分析 1.3 统计学处理 采用SPSS11.0进行单因素方差分析，P<0.05有显著性差异。 2 结果 2.1 MTT法检测 各组合金的细胞增值率P分别为1号合金(90.63%)、2号合金(87.10%)、3号合金(89.01%)、镍铬合金(92.11%)、金合金(98.90%)，2号合金、3号合金的细胞毒性为1级，表明各组的细胞毒性均为0级，各组之间无差异(P<0.05)。表1 MTT实验中各组OD值(略) 2.2 细胞线粒体跨膜电位的变化 各组合金荧光强度数值结果显示线粒体对罗丹明123摄取量下降，表明合金引起线粒体跨膜电位降低，导致电位去极化的发生。加样处理48h的L929细胞，同阴性对照组相比(P<0.05)。 2.3 Western-Blot 细胞线粒体和胞浆中的细胞色素C蛋白印迹(图1)表明细胞色素C从线粒体到胞浆的释放。胞浆中细胞色素C表达量为1号合金(0.721±0.047)、2号合金(0.934±0.046)、3号合金(0.869±0.002)、镍铬合金(0.831±0.036)、金合金组(0.647±0.027)，较阴性对照组(0.532±0.026)，结果为由低到高依次为F 3 讨论 近年来有关细胞凋亡的大量研究和生物医用材料的快速发展，人们越来越多关注生物材料与细胞，组织之间的相互作用及是否存在材料诱导细胞凋亡的现象。在凋亡因子的刺激下，细胞线粒体膜电位降低或消失，线粒体基质中释放出致凋亡活性物质，如细胞色素C，凋亡诱导因子AIF等[4]，这些物质进入胞核或胞质，最终导致细胞不可逆的凋亡。本实验通过将金属合金浸渍于细胞培养液中使金属离子释放，并用该培养液进行细胞培养来模拟金属合金对于机体的影响。研究表明金属离子引起细胞死亡的主要方式是凋亡，并具有浓度及时间依赖性[5]。罗丹明123是亲脂性阳离子荧光染料，线粒体膜只有在维持生理状态跨膜电位(ΔΨm)的情况下才能对罗丹明123进行有效摄取，否则摄取量下降[6]。线粒体电位去极化导致荧光染料的摄入量下降是大多数细胞凋亡的早期事件，其发生意味着线粒体功能发生损伤[7]。结果表明处理后的各组细胞和阴性对照组比较，细胞线粒体膜电位开始发生去极化，表现为荧光强度下降，说明细胞对罗丹明123的摄取量下降，显示合金浸提液作用于细胞48h后能促使线粒体的膜电位下降，伴有细胞色素C从线粒体到胞浆的释放过程。细胞色素C是第一种被发现的线粒体释放的促凋亡蛋白。释放入胞质的细胞色素C与凋亡活化因子(APAF-1)结合,形成细胞色素C/APAF-1复合体。该复合体可使无活性的caspase-9原发生活化,继而形成细胞色素C/APAF-1/caspase-9复合体,此复合体继续作用于下游的caspase-3[8]。研究发现合金材料引起细胞细胞色素C的表达变化差异，可能是在口腔这一复杂的电解质环境中，不同合金的化学稳定性不同所致，通过对大量金属材料的浸提发现，贵金属合金中的成分如金、钯等很少析出，主要为合金中的非贵金属如镍、铜等。这是因为贵金属的化学性质稳定，不易发生化学反应[9]。实验中金合金组和阴性对照组的细胞色素C的表达量比较，差异不明显，反应了金合金组优异的生物相容性。研究结果表明，齿科合金可促使下降和细胞色素C释放可能是其诱导L929细胞凋亡的途径之一。关于金属材料诱导细胞凋亡的可能其他信号转导途径及作用机制，还有待于进一步的研究证实。 【参考文献】 [1]Watha Jc.Alloys for prosthodontic restoration[J].Prosthe Dent,2002,87：351 [2]John C.Wataha,Steven K.Nelson,Petra E.Lockwood.Elemental release from dental casting alloys into biological media with and without protein[J].dental materials,2001，(17):409414 [3]International Standards Organization.Biological evaluation of medical devices[M].Part5:Tests for cytotoxicity:in vitro methods，1997，1099310995 [4]Green DR,Reed JC.Mitochondria and apoptosis[J].Science,1998,281:13091312 [5]战德松,吕娇,赵奇.Death patterns of the mouse fibroblast cell L929 induced by ferritestst ainless steel inmagnetic attachment[J].金属学报,2006，(42)8:892896 [6]Zamzami N,Susin SA,Marchetti P.Mitochondria control of nucleate apoptosis[J].J Exp Med，1996,183:15331544 [7]Petit PX,Lecoeur H,Zorn E，et al.Alterations in mitochondrial structure and function are early events of dexamethusore-induced thymocyte apoposis[J].J cell Biol,1995,130:157167 [8]Zou H,LiYc,Liu X,et al.An APAF-1-Cytochronme-C-multimeric complex is afunctional apoptosome that activates procaspase-9[J].J Biol Chem,1999,274:11549556 [9]曹洪喜.牙科合金腐蚀产物及其致突变性和致炎性[J].国外医学生物工程分册，1999，(22)：110113 |