高原低氧环境下大鼠肾脏血红素氧合酶-1的表达及意义

　　【摘要】 目的研究高原低氧环境下大鼠肾脏血红素氧合酶-1(HO-1)mRNA及蛋白的表达、分布及活性变化情况。方法 将60只雄性Wistar大鼠随机分为高原组(50只，海拔4600m)和对照组(10只，海拔1500m)，高原组又分为1、3、7、14、21d组(每组均为10只大鼠)。用Western blot法、RT-PCR及免疫组化染色标记法检测HO-1基因及蛋白的表达及分布情况。结果 与对照组比较，高原组HO-1mRNA在第一天就呈现表达上升(0.75±0.10，P<0.05)，在第三天时达峰值(0.94±0.07，P<0.05)，差异有统计学意义，以后逐渐下降，直至接近于对照组。HO-1蛋白在大鼠到达高原时即呈现表达升高(0.35±0.03)，7d时达高峰(0.68±0.03，P<0.05)，差异有统计学意义，以后逐渐下降，直至接近对照组。 结论 在高原低氧环境下，大鼠肾脏HO-1mRNA及蛋白的表达会随时间发生改变，在缺氧早期呈上升趋势，后逐渐下降到正常水平，其改变可能与机体对缺氧的耐受性及对高原低氧产生习服有关。

　　【关键词】 血红素氧合酶-1 高原低氧 肾脏

　　EXPRESSION OF HIGH ALTITUDE HYPOXIA ON HEMEOXYGENASE-1 IN RATS KIDNEY

　　Zhu Dan1 , Chu Yide2, Hu Wenbo2, Ge Rili1

　　(1.Medical College of Qinghai University;

　　2.Department of Nephrology, Qinghai Provincial people’s hospital,Xining;

　　3.Research Centre for High Altitude Medicine,Qinghai University Medical School)

　　Abstract Objective To investigate the changes of heme oxygenase-1(HO-1) in rats kidney exposed to hypoxia at high altitude. Methods 60 male Wistar rats were randomly divided into five testing groups and one control group. The testing groups were transported to Ke-ke-xi-li Natural Reservation areas (4600 m above sea level) in Qinghai Province. Five testing groups were sacrificed and their tissue samples were gained after they lived at high altitude for 1d, 3d, 7d, 14d, 21d, respectively. The control group was treated in Lanzhou (1500m above sea level). Using Reverse transcription PCR, Western blot analysis and Immunohistochemistry assay to examine the expression of HO-1 mRNA levels and protein.Results The level of HO-1 in rats increased at first day after exposure to hypoxia altitude (0.75±0.10, P<0.05), and reached its highest level at 3d (0.94±0.07, P<0.05).Then it decreased gradually and was similar to the control group at 21d. Conclusion The HO -1 level will change after the rats are exposed to high altitude; it increases in early period and decreases in later period. This change seems to be related to degree of hypoxia and adaption to high altitude.

　　Key words Heme oxygenase-1 High altitude Hypoxia Renal

　　血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)是血红素代谢的限速酶，可催化血红素生成胆绿素和一氧化碳，胆绿素继而转化成胆红素，发挥重要的抗氧化作用。近年来研究表明，血红素在大鼠肾脏缺血再灌注损伤、肾衰竭及毒物所致肾脏损伤中均呈现肾保护作用[1，2]。本研究将大鼠由低海拔地区运至高原地区，研究在高原低氧环境下HO-1在大鼠肾脏的表达、分布及活性变化。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物：健康雄性Wistar大鼠60只，体重180～200g,由甘肃中医学院动物实验中心提供[动物合格证号：SCXK(甘)2004-0006]。

　　1.1.2 主要试剂及仪器：cDNA第一链合成试剂盒(TIANDZ)、2xTaq PCR MasterMix(TIANGEN)、山羊抗鼠HO-1多克隆抗体及辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊IgG(Santa Cruz)、GAPDH(Santa Cruz)、山羊超敏二步免疫组化试剂盒由北京中衫金桥生物技术公司提供。仪器采用美国Bio-RAD梯度PCR仪，电泳仪。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 分组及动物模型复制：将实验动物随机分为兰州对照组(10只)、高原组(50只)，根据缺氧时间不同将高原组分为1、3、7、14、21d 5个组。大鼠经腹腔麻醉后，自腹主动脉取血，高速离心后取上清液保存于液氮罐中备用;摘取两侧肾脏，去除包膜，一侧肾脏装入冻存管保存于液氮罐备用，一侧肾脏切开冠状面后置10%甲醛溶液中固定保存。

　　1.2.2 大鼠外周血血氧饱和度测定：在实验动物处死前应用TUFFSATTM型血氧仪检测外周血(左后肢)血氧饱和度(SaO2)。

　　1.2.3 组织总RNA提取及RT-PCR反应：取大鼠肾髓质组织100 mg进行匀浆后按照动物RNAout试剂盒说明方法提取总RNA，再按照逆转录试剂盒说明方法进行反转录得出cDNA。扩增引物参照Hui-hua Wang等[3] 设计，序列如下：HO-1正义链5'- ACT GCT GAC AGA GGA ACA CAA A-3';HO -1反义链5'-CAA CAG GAA ACT GAG TGT GAG G-3'，扩增长度为181 bp左右，内参GAPDH引物序列：正义链5'- AAT GCA TCC TGC ACC ACC AA-3';反义链5'- GTA GCC ATA TTC ATT GTC ATA-3'，扩增长度516 bp，引物由上海生工公司合成。PCR反应条件：①94℃ 3min 激活PCR反应;②PCR循环：94℃ 变性30 s,60℃(GAPDH为53℃)退火45 s,72℃延伸45 s，共40个循环;③72℃最后延伸8 min。扩增产物进行琼胶电泳，采用图像分析软件Quantity One4.50(Bio-Rad,美国)比较电泳条带的相对光密度值，获得HO-1 mRNA的相对表达量。

　　1.2.4 HO-1蛋白检测：依Western blot法按比例将组织混合于细胞裂解液置低温下充分裂解，取上清液用Lowry法进行蛋白定量，取100 μg样品在100℃条件下加热4 min，行15%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳， 200 mAn恒流电转2 h，一抗4℃轻摇过夜(1：500稀释)，二抗室温振荡2 h，化学发光、显影。以GAPDH为内参照，采用1-D图像分析软件Quantity One4.50(Bio-Rad,美国)分析杂交条带的相对光密度值，获得HO-1 蛋白的相对表达量。

　　1.2.5 免疫组化染色：将肾组织从甲醛溶液中取出，用石蜡包埋后切片(厚度4μm)，用二步法检测，实验步骤按试剂盒说明书进行。一抗为山羊抗鼠HO-1多克隆抗体(Santa Cruz)，工作浓度为1：100，每次实验设立阴性和阳性对照。切片采用DAB染色法，阳性染色标准为细胞胞浆呈棕黄色。采用半定量分析法分析染色结果，每张切片在100倍高倍镜下取10个视野，无染色为0，肾小管染色数量<5%为(+)，(++)为5%～, (+++)为20%～; (++++)为33%～ [4]。

　　1.3 数据统计学处理方法

　　实验数据用平均值±标准差表示，组间比较采用F检验。用SPSS 13.0统计软件行one-way ANOVA检验,显著性检验水准为α= 0.05。

　　2 结果

　　2.1血氧饱和度检测结果

　　大鼠进入高原地区后，SaO2较对照组明显下降(P<0.05)，在3 d组处于较低水平，7 d组较前回升，但仍明显低于对照组，与14 、21 d组比较没有统计学意义(P>0.01)，见表1及图1。表1大鼠外周血SaO2值

　　2.2 RT-PCR检测结果

　　逆转录PCR检测结果显示，肾组织HO-1 mRNA的表达呈现先升高后降低的变化趋势，从大鼠进入高原第一天起，HO-1的表达量就开始升高(0.75±0.1)，并且与对照组比较有统计学意义(P<0.05),到第三天已达高峰(0.94±0.07,P<0.05)，然后表达量逐渐下降,直到21d 时HO-1m RNA的表达水平与对照组接近(P>0.05)，见图2及表2。

　　图2 不同低氧时间大鼠肾脏HO-1 mRNA的表达

　　2.3 肾组织HO-1蛋白的表达检测结果

　　Western蛋白印迹检测结果显示，大鼠肾脏HO-1在32KD处有清晰明显的表达条带，1、3d组较对照组逐渐上升，7d组目的蛋白表达最多(P<0.05)，14、21d组表达则逐渐下降，见图3及表2。

　　图3 不同低氧时间大鼠肾脏HO-1蛋白的表达

　　2.4 免疫组织化学检测结果

　　大体观察HO-1阳性染色主要位于髓质及皮髓质交界处远曲小管和集合管细胞的胞浆中，肾小球的阳性表达很少。与对照组比较，1、3、7、14d HO-1的表达水平均逐渐增高(P<0.05)，7d值达峰值(P<0.05)，以后逐渐减少，21d组的表达并不明显，与Western检测结果基本一致。表2不同低氧时间HO-1基因及蛋白的表达(x±S)注：* 与对照组比较，P<0.05; # 与同组其他低氧时间段比较，P<0.05

　　3 讨论

　　自1968年Tenhunen等证实HO是催化血红素降解的主要酶类以来，人们对于HO的研究就从未停止过， 20世纪80年代后期，Motterlini[5]等发现了HO的诱导型同工酶即HO-1，并证实其就是热休克蛋白32，从此揭开了HO-1作为应激反应蛋白研究的新阶段。HO-1作为低氧诱导因子α-1(HIF-1α)的下游基因，在氧化应激方面发挥着重要作用。HIF-1α对HO-1的调节主要发生在转录水平[6]，其调节机制极其复杂，有多个转录因子参与HO-1基因的表达，包括Nrf2(nuclear factor erythroid 2 p45 subunit-related factor 2)、NF-κB (nuclear factor κB) 和 HSF-1 (heat-shock factor 1)[7-9]。Qi-Fang Li[10]等发现，将大鼠间断暴露于低氧环境下诱导产生肺动脉高压，其肺动脉管壁上HO-1的基因表达与HIF-1α的表达具有相关性，并且HO-1的表达对HIF-1α的表达具有负反馈调节作用。本实验中HO-1表达变化的趋势与上述报道相一致，其可能机制是，低氧初期肾脏组织中HIF-1α大量表达，从而上调HO-1 mRNA及蛋白的表达，7d时表达量达最高，同时血液中的HO-1浓度可能也是最高的，继而体内发生负反馈调节机制，高浓度的HO-1抑制了HIF-1α的表达，使HIF-1α的表达量下降，作为其靶基因的HO-1的表达量随之下降。

　　HO-1主要分布于肾皮质的近端、远端小管以及肾髓质的集合管和髓袢的上皮细胞内，并存在皮-髓质梯度，髓质中HO-1表达明显高于皮质。本实验免疫组化检测结果显示HO-1在肾脏中的表达、分布情况与以上文献所示结果一致。这可能与肾髓质的低血流量和低氧压有关[5]，低氧时这种分布的特点尤其突出。HO-1在髓质中高表达可以通过CO的扩血管作用及胆红素的抗氧化作用来保护髓质细胞免受缺氧及氧自由基损伤[9]。

　　机体内HO-1在NADPH及O2的参与下催化血红素降解，生成胆绿素、一氧化碳、亚铁离子，其中胆绿素又在胆绿素还原酶的作用下生成胆红素，胆绿素、胆红素是体内最强的抗氧化剂。HO-1对肾脏的保护作用主要表现在以下几方面：①HO-1可增加细胞的抗氧化作用，防止肾小管上皮细胞氧化损伤[11]，对于急性肾小管损伤后肾功能的恢复起着重要作用[12]。 ② 其代谢过程中产生的CO是重要的血管活性物质，可扩张血管，调节血管张力[13]，同时还可影响其他内源性血管活性物质和NO[8] ;肾脏中HO或CO水平的增高，不仅有助于改善肾功能，也有助于调节血压。③HO-1对机体内铁的再利用具有重要作用。研究发现HO-1缺陷的大鼠伴有缺铁性贫血，而其肝、肾中的铁却无法利用，从而造成这些组织氧化损伤和慢性感染。④HO-1通过抑制NF-κB的活性来下调单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)，从而起到抗炎症反应的作用[14] 。⑤HO-1可以上调Bal-2基因表达而有效抑制冷储藏后再灌注肾内细胞凋亡的发生[15]。

　　很多研究证实，各种肾损伤保护机制中，HO-1都发挥着一定的作用。在甘油所致肾衰竭、肾缺血再灌注损伤等多种肾脏病理情况下，HO-1的表达量均会有一定程度的上升，在维持肾脏血流动力学机能、抵抗内皮机能障碍及抗氧化损伤方面发挥重要作用[16～18]。近期，国内研究也发现，在肾缺血之前诱导HO-1高表达，可通过清除氧自由基(OFRs)、抗凋亡而减轻肾脏损伤。本研究结果提示，HO-1可能通过前述肾脏保护机制保护了肾脏组织。但本实验主要是就生理条件下高原低氧对肾脏HO-1变化的影响进行了研究，病理条件或提前诱导HO-1表达对肾脏功能的影响，及HO-1 表达与肾功能的具体关系有待于进一步研究。

　　本研究提示，从低海拔地区进入高原，HO-1发生变化的可能机制是低氧环境诱导HIF-1α表达，进而上调肾小管上皮细胞HO-1mRNA及蛋白的表达，使其催化血红素降解的作用增强，继而发挥更强的抗氧化作用，保护肾小管上皮细胞免受氧化损伤;模拟低氧试验研究及高原现场研究表明急性低氧环境下可出现血压升高[19]，一氧化碳可以充分发挥血管活性作用，扩张血管，调节肾小球毛细血管血压和管球反馈;亚铁离子可诱导铁蛋白产生，铁蛋白作为一个“储存库”可限制铁参与过氧化氢及超氧阴离子的生成，从而减少肾小管上皮细胞活性氧族的毒性反应。但胆红素的抗氧化作用仅在一定浓度范围内发生，缺氧后期，HO-1水平下降，有利于防止胆红素浓度过高伤害组织，这可能也是低氧习服的机制。因此，HO-1蛋白及基因的表达量达峰值后会随着低氧时间的延长而开始减少，肾脏的机能也逐步改善。

　　本文初步探讨了大鼠在进入高原不同时间点肾脏HO-1基因及蛋白的表达变化情况。其对进一步研究HO-1对肾脏的保护作用具有一定的指导意义。

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