体外传代培养对大鼠血管平滑肌细胞OPN mRNA表达的影响

　　【摘要】 目的探讨体外传代培养对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)表型标志分子骨桥蛋白(Osteopontin， OPN)mRNA表达的影响。方法选择未经培养传代的VSMCs和体外传代一至五代的VSMCs作对比研究。 用RT-PCR法检测VSMCs中OPN mRNA相对表达水平。结果 体外培养至第一代时，VSMCs 的OPN mRNA表达量较原代VSMCs显著增高(P<0.01)，且随传代代数的增加有逐渐增高趋势。结论 OPN在原代VSMCs中表达甚微，体外培养可促使VSMCs多量表达OPN，OPN为VSMCs合成表型标志分子，即体外培养可促使VSMCs从收缩表型转为合成表型。

　　【关键词】 血管平滑肌细胞；表型；体外培养；骨桥蛋白

　　INFLUENCE OF IN VITRO CULTURE ON OPNmRNA EXPRESSION OF VASCULARSMOOTH MUSCLE CELL IN RATS

　　Wang Shenglan1, Liu Huiqi1, Liu Jie1, Cao Xuefeng1, Wang Shuren2

　　(1.Pathophysiology Department of Qinghai University Medical College;

　　2. Basic Medical Sciences and Forensic Medicine School of Cichuan University)

　　Abstract Objective To study the influences of in vitro subculture on Osteopontin (OPN) mRNA expression of vascular smooth muscle cells(VSMCs)in Rats. Methods compared the primary VSMCs with first to fifth passages and detected relative expression of OPN mRNA by RT-PCR. Results Expression of OPN mRNA in the first passage was higher than primary VSMCs (P<0.01) and it was gradually higher with passages increasing. Conclusion Expression of OPN in primary VSMCs is less whereas culture in vitro can increase its expression. OPN is the marker of synthetic phenotype in VSMCs and culture of VSMCs in vitro can transform the contractile phenotype into the synthetic phenotype.

　　Key words VSMCs Phenotype Culture in vitro OPN

　　血管平滑肌细胞 (vascular smooth muscle cells,VSMCs )分为分化型(收缩型)和去分化型(合成型)两种表型。损伤后在生长因子作用下,VSMCs 可由分化型转变为去分化型,从中膜向内膜下迁移并增殖,合成大量细胞外基质( extracellular matrix,ECM),这个过程称为表型转化[1]。在高血压(Hypertension)、动脉粥样硬化 (AS )和血管成型术后再狭窄(RS)等血管病变发生时,VSMCs在新生内膜形成过程中暂时变成分化程度较低、更接近胚胎期的未分化表型,而在增厚的新生内膜中,VSMCs又逐渐恢复为分化表型。在血管病变部位,表型发生转化的 VSMCs在增殖的同时合成与分泌各种细胞因子和细胞外基质,在 AS斑块形成和 RS发生过程中发挥重要作用。由于多种心血管疾病都涉及到VSMCs的增殖及表型转化。前期研究中，在以细胞为材料的实验方法中多采用3至6代的细胞作为研究对象，故采用原代细胞和体外培养至第四代的细胞作对比研究。结果表明，体外培养至第四代，VSMCs表型可发生转化[2]，为进一步确定体外培养与表型转化的关系，明确体外培养至第几代细胞时表型可能发生转化，本课题对此进行了研究。现将有关内容报告如下：

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　SD大鼠由四川中药研究所提供;Ⅰ型胶原酶(Collagenase Ⅰ)、胰蛋白酶(Trypsin)、DEME/F12干粉状培养基购自GIBCO.BKL公司;Biozol总RNA提取试剂盒、RT-PCR两步法试剂盒购自博瑞克公司;小牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所、 PCR扩增引物由invitrogen公司合成。凝胶成像系统为Bio-Rad公司产品。

　　引物序列：OPN(骨桥蛋白，486bp)，正义5'-TGG CTT ACG GAC TGA GGT CA-3'，反义5'-GAC CTC AGA AGA TGA ACT C-3';L19(Ribosomal protein, 核糖体蛋白，内参，194bp)，正义5'-CTG AAG GTC AAA GGG AAT GTG-3'，反义5'-GGA CAG AGT CTT GAT GAT CTC-3'。

　　1.2 方法

　　1.2.1 VSMCs的分离培养

　　纯种雄性SD大鼠(体重180～220g)无菌条件下分离胸腹主动脉，移入超净台，刀背刮去内膜，从外膜上撕下中膜，用Ⅰ型胶原酶消化分离VSMCs。分离培养的原代细胞按1×105/mL细胞数接种于75 mL培养瓶中，用含20%小牛血清DMEM/F12培养基传代培养。

　　1.2.2 RNA的提取

　　酶消化原代及传代培养的VSMCs以2×105/mL细胞数接种于50 mL的培养瓶中,在37℃、5%CO2培养箱中培养生长至80%后，用Biozol提取总RNA,方法按试剂盒说明进行。

　　1.2.3 RT-PCR的扩增

　　1.2.3.1 逆转录合成cDNA(reverse transcription,RT):

　　取RNA模板1 μg，5×RT Buffer 4 μL，10 Mm 的dNTPMixture 2 μL，super-RI 0.5 μL, RT-Enhancer 0.5 μL, 50 pmol/μL 的Oligo(dT)181 μL， Rever Tra Ace 1 μL,加无RNA酶水至总体积为20 μL,42℃反应40min,99℃反应5 min灭活逆转录酶,合成的cDNA用于PCR反应。

　　1.2.3.2 PCR 反应：

　　取cDNA 5 μL, 20 μM的上、下游引物各1 μL，2×Taq PCR MasterMix12.5 μL, 加ddH2O至总反应体积为25 μL,进行PCR扩增。扩增条件为94℃ 1 min ，57℃ 1 min，72℃ 1 min。均进行30个循环。最后72℃延伸10　min。L19为内参照。PCR扩增完毕后取5 μL在1.5%琼脂糖凝胶中行电泳分析, 采用凝胶成像系统(Quantity One软件)对电泳影像进行光密度扫描，以各代OPN条带光密度与内参L19条带光密度比值表示目的基因mRNA相对表达水平。

　　1.2.4 统计学处理方法

　　数据采用(x±S)表示,应用SPSS 11.5统计学软件ANOVA进行统计学分析，显著性检验水准α=0.05为有显著性差异。

　　2 结果

　　RT-PCR结果显示，原代血管平滑肌细胞合成表型标志分子OPN微量表达，体外培养使OPN表达显著增加，且随传代代数增加有逐渐增加的趋势，各代和原代相比差异均有显著性(P<0.01)。结果见表1、图1。表1体外传代培养对VSMCsOPNmRNA表达的影响(n=3，x±S)

　　3 讨论

　　VSMCs 在胚胎发生期来自中胚层,在以后的发育过程中,逐渐分化为不同的细胞群,并获得具有成年特征的分化表型。根据结构和功能的不同, VSMCs可分为收缩型(分化型)和合成型(未分化型或去分化型)两种表型。这两种表现型可能代表了共存于血管壁内一系列不同表现型的两个极端类型,他们对自分泌和旁分泌因子、基质有不同的反应,并表达不同的基因和蛋白[3]。合成型VSMCs可以分裂、增殖及迁移,但收缩蛋白和肌纤维成分少,收缩功能差。收缩型VSMCs收缩功能好,但不再增殖、分化和迁移,合成 ECM的能力较低,对生长因子几乎无反应,处于细胞周期的静止期。血管壁由不同种类的 VSMCs构成, 发生表型转化后由不同功能的特殊亚群细胞执行着不同功能[4] 。平滑肌细胞的表型转换(由收缩表型 →合成表型)是平滑肌细胞迁移、增殖的先决条件[5], SMC向内膜的迁移、增殖, 在动脉粥样硬化病变发生过程中起关键作用，合成表型具有比收缩表型强得多的分泌合成基质的功能，且易于发生脂质沉积。 因此，动脉壁中平滑肌细胞表型转换可能是As早期病变形成中一个重要的始动性变化，增生的平滑肌细胞产生大量细胞基质[6，7 ],最终形成动脉硬化。

　　OPN被认为是合成表型的标志物之一[8]。它是血管细胞的主要黏附及趋化因子,还与动脉粥样硬化斑块的钙化密切相关。近年来的研究表明， OPN在大鼠血管损伤后新生内膜中的表达明显上调,而且它能促进血管平滑肌细胞、外膜细胞的迁移,被认为是血管损伤修复过程中重要的始动因素[9]。 OPN主要通过两种机制发挥细胞信号分子的作用。一是以分子内 RGD 基元与整合蛋白(integrin)家族分子结合;二是与细胞表面黏附性糖蛋白 CD44 以非 RGD 依赖方式结合。两种作用方式均通过激活细胞内特异性信号传导系统而介导细胞黏附、迁移和增殖[10]。

　　研究表明[2]，OPN在收缩和合成两种表型中重叠很小，是合成表型的典型标志性分子之一。本研究中，体外培养第一代既可使OPN表达增加，且随传代代数的增加有逐渐增高的趋势。进一步证明体外传代培养可使VSMCs从收缩表型转化为合成表型，促进VSMCs的移行、增殖。体外培养引起OPN表达增加的机制如何，通过何种信号转导途径，有待进一步探讨。

　　【参考文献】

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