胃癌组织中CTGF蛋白表达与细胞凋亡的相关性

　　【摘要】 目的探讨结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)蛋白在胃癌组织中的表达及它与细胞凋亡间的关系。方法应用免疫组织化学方法检测CTGF在10例正常胃粘膜、50例癌旁组织和胃癌细胞中的表达,同时利用原位末端标记技术(TUNEL) 检测癌组织中的细胞凋亡指数(AI),并分析它们之间的关系。结果 CTGF正常组织的阳性表达率为10%，在癌旁组织的表达率为30%，在胃癌组织的表达率为32%;凋亡指数在CTGF阴性组为5.72±1.12，在CTGF阳性组为1.32±1.08，两组比较差异有显著性(P <0.001)。CTGF的阳性表达与胃癌的分化程度、临床分级、淋巴转移与否有关(P <0.05)。但与胃癌患者的年龄、性别、肿瘤直径、浸润深度无明显关系(P >0.05)。结论 CTGF可能在胃癌凋亡过程中起重要作用。

　　【关键词】 胃癌组织；CTGF蛋白表达；细胞凋亡

　　RELATIONSHIP BETWEEN EXPRESSIONS OFCTGF PROTEIN WITH APOPTOSIS IN GASTRIC CARCINOMA

　　Li Juying1， Gou Xiaodan2， Zhao Gang1， Yang Yong 2

　　(1.Dept of Pathology， Qinghai University Medical College;2. Qinghai University Affiliated)

　　Abstract ObjectiveTo detect the expression of connective tissue growth factor (CTGF)in gastric carcinoma and the relationship with apoptosis. Methods The expression of CTGF in 10 cases of normal gastric mucosa and 50 cases of gastric carcinoma were detected by immunohistochemistry. At the same time, apoptosis index (AI) was detected the in cancer tissues using TUNEL technology. Results The expression of CTGF was higher in gastric carcinoma(32%) than normal gastric mucosa(10%)，(P=0.02).The AI between the CTGF positive group was (1.32±1.08) and control group was 5.72±1.12,P < 0.001. Expression of CTGF was highly correlated with the carcinoma's degree of differentiation and expression of CTGF in lymph node metastasis (P<0.05).There was no obvious relationship among CTGF and tumors site ,invasion depth and the patients age and sex(P> 0.05) .Conclusion CTGF may play an important role in the gastric cancer apoptosis process.

　　Key words Gastric carcinoma Apoptosis CTGF

　　结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)属于早期即刻基因,1991年在人的脐静脉毛细血管内皮细胞中发现,是富含谷氨酸的蛋白质，在正常情况下具有多种生物功能：参与伤口的愈合、细胞间黏附、炎细胞趋化、细胞凋亡诱导、肿瘤生成[1]。为了解CTGF蛋白在胃癌组织中的表达及它与细胞凋亡间的关系，本课题就胃癌组织中CTGF蛋白表达与细胞凋亡的相关性开展相关研究。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 标本：收集青海大学附属医院2007年9月～2008年9月间的胃癌切除标本(标本均经病理证实)50例(为实验组),其中男性41例，女性9例;年龄35～80岁，平均55.7岁;高分化8例，中分化15例，低分化27例。距癌灶5cm远组织作为癌旁组织。对10例正常体检者在征得本人同意情况下在胃镜下取正常胃粘膜作为对照组。各组患者术前均未接受过放化疗。

　　1.1.2 主要试剂 ： 鼠抗人多克隆CTGF浓缩型工作液购自美国R&D system corporation; HistostainTM-plus kits 试剂盒、浓缩型DAB显色试剂盒、多聚赖氨酸均购自北京中杉金桥生物科技有限公司;TUNEL试剂盒购自凯基生物科技发展有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 CTGF免疫组织化学染色法：所有组织均经10%甲醛溶液固定，组织大小为1cm×1cm×1cm,胃镜取米粒大小组织2～4块，常规石蜡包埋,连续切片(厚度4 μm)，石蜡切片经过二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水后，加3%H2O2 封闭内源性过氧化物酶，室温下置10 min，PBS液洗3次，每次5 min，切片放入0.01 mol/L拘橼酸钠抗原修复液中行间接抗原修复(高压，10min)，室温冷却，PBS液洗3次，每次5 min，加一抗，置4℃冰箱过夜。PBS液洗3次，每次5 min，将用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗置37℃温箱1 h，PBS液洗3次，每次5 min，用新鲜配制的二氨基联苯氨(DAB)显色液显色;用PBS液代替一抗作阴性对照，苏木素复染，中性树胶封片。结果用光学显微镜观察判定：在细胞浆内出现棕黄色颗粒者视为阳性。

　　1.2.2 细胞凋亡的原位末端标记法：采用DNA 末端转移酶介导的BiodUTP 末端标记技术(terminal deoxynucleotidl transferasemediated dUTP biotin nick end labeling, TUNEL )。所有石蜡切片按常规方法进行二甲苯脱蜡2次，每次5 min，梯度酒精脱水3次，每次5 min，用PBS液漂洗2次，每次3 min，吸干组织周围水分，加入蛋白酶K在37℃温箱内消化30 min，PBS液漂洗2次,每次3 min,吸干组织周围水分,加入鲜配制的3%甲醛过氧化氢封闭液在室温下封闭10 min,PBS液漂洗2次，每次3 min，吸干组织周围水分，加入新鲜配制的TdT酶反应液标记60 min;阴性对照组不加TdT酶,PBS液漂洗3次,每次3 min,用吸水纸吸干组织周围的水分,加终止工作液30 min终止反应,PBS漂洗3次，每次3 min，加入DAB显色液显色，在显微镜下控制着色，终止反应，PBS液漂洗3次，用苏木素复染，中性树胶封片。同时设阴性对照。结果用光学显微镜观察判定：在细胞核内出现棕黄色颗粒者视为阳性,计数并拍照。

　　1.2.3 结果判定方法：常规光镜下观察无CTGF阳性细胞为-,阳性细胞数≤25%为+,26 %～50 %为++, >50 %为+++ 。TUNEL标记阳性表达在细胞核内，计数50个高倍视野，细胞的凋亡用凋亡指数AI表示即AI=(凋亡的细胞数÷观察的细胞数)×100%。

　　1.2.4 统计方法：数据处理采用SPASS11.0软件。显著性检验采用χ2 检验和t检验,水准α= 0.05。

　　2 结果

　　2.1 CTGF在正常胃粘膜中的阳性表达

　　正常胃粘膜中，胃腺排列整齐，形态规则，CTGF在大多细胞中无表达,只散在表达在胃小凹腺体颈部细胞胞浆和胞膜中，在正常胃粘膜中CTGF的阳性表达率为10%，CTGF在胃癌细胞的阳性表达主要在细胞浆内(图A～D)，阳性表达率为64%，差异有显著性。见表1。

　　2.2 正常胃粘膜细胞的凋亡表达

　　通过原位末端标记发现，在正常胃粘膜细胞核内出现有较多的棕黄色凋亡小体(图E)，凋亡较多; 在癌旁组织中细胞凋亡比胃癌组织癌细胞的凋亡多(在这里仅比较CTGF阳性与CTGF阴性的胃癌组织中细胞凋亡，图F～H)。在染色阳性的胃癌组织中细胞凋亡的指数为2.18±0.78;在CTGF阴性的胃癌组织中细胞凋亡的指数为5.92±1.07， CTGF阳性组细胞凋亡指数明显低于CTGF阴性组细胞凋亡指数，差异有显著性(P <0.001)。见表3。

　　2.3 CTGF在胃癌组织中的阳性表达

　　CTGF的阳性表达与胃癌的分化程度、临床病理分级、淋巴转移与否有关。但与年龄、性别、肿瘤的大小及癌细胞的浸润深度无关，差异有显著性。见表2。表1不同组织中CTGF 表达阳性率比较注 ：*与正常胃粘膜比较P<0.05.

　　3 讨论

　　CTGF 属于CCN家族，该家族包括6个成员(Cyr61/CCN1、CTGF/CCN2、NOV/CCN3、WISP-1/CCN4、WISP-2/CCN5、 WISP-3/CCN6)[1]。CTGF蛋白是由349个氨基酸组成的富含半胱氨酸的多肽。CTGF属于即刻早期生长反应性基因，广泛存在于人类多种组织器官中，如结缔组织、心脏、脑、胎盘、肝脏、胰腺、肌肉和肺脏等。研究发现它与细胞增殖、分化、凋亡、黏附、胚胎发育以及伤口愈合等有关[2]。随着研究的深入，逐渐发现CTGF与肿瘤的关系也很密切，CTGF在肝细胞癌、弥漫浸润型胃癌、脑胶质瘤、食管腺癌中阳性或高水平表达者与阴性或低水平表达者比较,病情恶化快,肿瘤细胞的浸润转移能力强,患者生存期短,预后差。我们通过对正常胃粘膜、胃癌组织和癌旁组织研究发现：在正常胃粘膜组织中CTGF只表达在胃小凹颈部粘液细胞的胞浆中，CTGF在胃癌组织中的阳性表达在胞浆和胞核中，染色明显增强，尤其在低分化胃癌细胞中强阳性表达明显较高中分化组大，CTGF的阳性表达与胃癌的分化程度有关，分化程度越低，CTGF的表达越强，与文献报道的结论一致[3-5]。癌旁组织中CTGF阳性表达的细胞数目明显多于正常胃粘膜组织，差异有显著性(P<0.05);在有淋巴结转移组中CTGF阳性表达也明显高于无淋巴结转移组,具有显著的统计学意义(P <0.05);在临床分期中，Ⅲ+Ⅳ组的阳性表达率(78.6%)明显高于Ⅰ+Ⅱ组(45.5%),具有显著的统计学意义(P<0.05)。而CTGF的阳性表达与患者的年龄、性别之间无明显关系(P >0.05)。通过本次研究结果显示，CTGF高表达患者与肿瘤细胞分化相对较差、有淋巴结转移和病期相对较晚相关。因此我们认为，CTGF在肿瘤恶化的过程中起到促进作用，CTGF可能是肿瘤的一个潜在的促肿瘤形成因子。CTGF可以促进肿瘤血管生成,导致肿瘤细胞的转移。CTGF可介入细胞周期,影响细胞的有丝分裂,其通过调控细胞周期素A(CyclinA)基因的表达,升高CyclinA水平,使细胞从G1期进入S期的周期缩短，促使细胞无限增殖,促进了肿瘤的发生与发展过程。也有一些研究发现CTGF在食管鳞状细胞癌[5]、甲状腺癌[6]、结直肠癌[7]中可作为肿瘤抑制因子发挥作用。在不同的肿瘤中CTGF发挥的作用可能也不同。表2CTGF阳性表达与胃癌临床病理因素间的关系表3胃癌组织中细胞的凋亡与CTGF表达的关系(x±S)

　　细胞凋亡功能降低导致细胞过度增生是肿瘤形成和发展的主要原因之一,细胞凋亡时,染色体双链DNA会出现许多不对称的断裂点,暴露出3′-OH末端,在脱氧核糖核苷酸末端转移酶( TdT)的作用下,不需要模板就可以催化地高辛、生物素或荧光素等标记的脱氧核糖核苷酸结合到DNA的3′-末端。本实验中，在CTGF阴性表达组细胞凋亡指数明显高于CTGF阳性组,差异有显著性(P<0.001)。CTGF基因在诱导细胞凋亡时导致caspas3活性降低，从而使本应进入凋亡程序的细胞没有被识别,使之得以生存并增殖。

　　通过本实验发现，CTGF的阳性表达随着胃粘膜病变的加重而逐渐增强，且与胃癌的分化程度、临床分级、淋巴转移与否等有关。所以在临床上可以将CTGF作为胃癌早期诊断和预后判断的一个指标。但是CTGF在胃癌的发病过程中具体以什么方式影响肿瘤的演进还有待进一步研究。今后以CTGF与胃癌相互关系的研究为基础，可能在胃癌的靶向治疗上会有新的突破。

　　【参考文献】

　　[1] Bradham DM,Igarashi A,Potter RL,et al . Connective tissue growth factor :A cysteine-rich mitogen secreted by human vascular endothelial cells is related to the SRC-induced immediate early gene produce CEF-10[J]. Cell Biol,1991，114 :1285-1294

　　[2] Babic M, Chen CC, Lau L F. Fis12/ mouse connective tissue growth factor mediates endothelial cell adhesion and migration through in tegrin alp havbeta3,promotes endothelial cell survival,and induces angiogenesis in vivo[J ]. Mol Cell Biol,1999,19 (4) :2958

　　[3] 曾志军,杨连粤,王伟,等. Cyr61, CTGF和Nov基因在肝癌细胞中的表达及与临床特征的关系[J]. 中华肝胆外科杂志,2005,11(7):452-454

　　[4] 杨常春,王穗暖,张一,等. 结缔组织生长因子在脑胶质瘤组织中的表达和肿瘤级别的关系[J]. 临床神经外科杂志,2006,3(3):89-101

　　[5] KoliopanosA, Friess H, DiMola FF, et al. Connective Tissue Growth Factor Gene Expression Alters Tumor Progression in Esophageal Cancer[J]. World J Surg, 2002,26(4):420- 427

　　[6] 陶秀平,张裕华,刘福云. 甲状腺癌CTGF、TGF-β1表达及其临床病理意义[J]. 医学临床研究,2005,22 (7):936-938

　　[7] 董秀明. 结缔组织生长因子可降低结直肠癌转移率[J]. 中华放射肿瘤学杂志, 2005, 14 (3):176