藏药青鹏胶囊抗病毒、抑菌作用实验研究

　　作者：卓玛措1 杨全余2 周小梅2 多杰拉旦2 作者单位：(1.青海卫生职业技术学院;2.青海省藏医药研究所)

　　【摘要】 目的观察青鹏胶囊对流行性感冒病毒的抑制作用和对感染FM1病毒小鼠的保护作用。方法1.应用细胞培养技术，在传代细胞上进行青鹏胶囊抗流感甲3和乙型病毒的抑制试验;2. 观察青鹏胶囊对感染FM1病毒小鼠的保护作用;3.采用试管液体稀释法测定青鹏胶囊对51株常见致病菌的抑菌作用。结果 1.青鹏胶囊对流感甲3型病毒有明显的中和、治疗作用，对乙型病毒中和、治疗作用不明显;2.中剂量青鹏胶囊能降低感染FM1动物的死亡率(P<0.05)，延长生存时间(P<0.05)，能降低大、中、小剂量组病毒感染小鼠肺指数，与模型组比较差异非常显著(P<0.01);3.青鹏胶囊提取液对金黄色葡萄球菌(10/10)、表皮葡萄球菌(10/10)、甲型链球菌(2/6)、乙型链球菌(5/5)、双歧杆菌(2/3)、肺炎杆菌(6/6)、绿脓杆菌(3/4)、致病性大肠杆菌(7/7)等革兰氏阳性球菌、阴性杆菌抑菌作用较好，其多数菌株的最低抑菌浓度在(6.25～100)mg/mL之间。尤其对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎杆菌、致病性大肠杆菌的抑菌效果明显。结论 青鹏胶囊对流感甲3病毒型具有明显的抑制作用。

　　【关键词】 藏药;青鹏胶囊;抗病毒;抗菌

　　THE ANTIVIRAL AND ANTIBACTERIAL EFFECT OF THETIBETANMEDICINE QINGPENG CAPSULE

　　Zhuo Macuo1, Yang Quanyu2, Zhou Xiaomei2, Dou jie La dan2

　　(1.Qinghai Vocational College of Health;2.Qinghai Tibetan Medicine Institute)

　　Abstract Objective

　　To study the antiviral and antibacterial effects of Qingpeng Capsule.Methods 1.To study the antiviral(influenza virus A3 and B)effect of Qingpeng Capsule in vitro on passage cell;2. To study the protection effect of QingPeng capsule for FM1 virus infected mice;3. To study the antibacterial effect of Qingpeng on 51 strains of common pathogenic bacteria. Results 1.Qingpeng Capsule is effective in neutralization and treatment for influenza virus A3,but not effective for influenza virus B;2. Middle dose of Qingpeng capsule can reduce the mortality rate in FM1 virus infected mice(P <0.05) and reduce lung index in low, middle and high dose of virus infection (P <0.01). it could also extend the survival time (P <0.05);3. Qingpeng capsule extractive solution showed an suppressive effect in Staphylococcus aureus (10/10), Staphylococcus epidermidis (10/10), alpha streptococcus (2 / 6), beta streptococcus (5 / 5), Bacillus bifidus (2 / 3), pneumobacillus (6 / 6), Bacillus aeruginosus (3 / 4), enteropathogenic E.coli (7 / 7) and other Gram-positive cocci, Gram-Negative bacillus. The minimum inhibitory concentration was around 6.25-100mg/ml. In particular, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, pneumobacillus, enteropathogenic E.coli strains were significantly inhibited. Conclusion Qingpeng Capsule is shown a remarkable antiviral effect on influenza virus A3.

　　Key words Tibetan medicine Qingpeng capsule Anti-viral Antibacterial

　　青鹏胶囊是由细叶草乌、高山辣根菜、肾瓣棘豆、麝香等十五味药材组成的藏药复方制剂，为藏医古验方，藏文译音“那宝格交”，最早收载于藏医南派创始人苏喀·年木多杰的经典著作《藏医千万舍利》，具有防瘟疫、清肺热的功效，主要用于瘟疫所致的胸腔脏器热症、瘟疫侵肺及流行性感冒引起的头痛、胸肋热痛、发烧、咯血等症状，至今已有500多年的历史，是藏医防治瘟疫及传染性疾病的首选药物之一，对治疗流行性感冒有较好的疗效，但其确切效果不明。

　　本文通过小鼠肺指数及肺指数抑制率测定试验;病毒感染小鼠死亡保护和延长生命试验;药物对细胞毒性试验;药物对流感甲3型、乙型病毒的直接杀伤作用试验;药物对流感甲3型、乙型病毒的治疗作用试验;药物对致病菌的体外抑制作用试验开展相关研究，探讨藏药青鹏胶囊的抗病毒及抑菌作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 药物：青鹏胶囊，0.3g/粒，青海省藏医药研究院生产(批号：051117)，将青鹏胶囊干粉5 g加蒸馏水至50 mL，水浴煮沸20 min，离心(2000rpm)10 min，无菌取上清液29.4 mL(0.17g生药/mL)4℃保存备用;双黄连口服液，哈药集团三精制药有限公司生产(批号：06011832);利巴韦林注射液，山东新华制药股份有限公司生产(批号：0504005)。

　　1.1.2 细胞：MDCK传代细胞，由中国中医科学院西苑医院基础研究室提供。

　　1.1.3 病毒：流感甲3、乙型病毒，由中国预防医学科学院病毒所提供，TCID50(使半数细胞培养管出现病变的病毒稀释度对数)分别为10-3.8、10-4.5，试验时用100个TCID50/0.1 mL;流感病毒亚甲型鼠肺适应株(FM1)，由中国预防医学科学院病毒所提供。鸡胚传代2次增毒后血凝滴度为1：640，对小鼠LD50为10-4.187。

　　1.1.4 细菌：金黄色葡萄球菌(10株)、表皮葡萄球菌(10株)、肺炎杆菌(6株)、甲型链球菌(6株)、乙型链球菌(5株)、绿脓杆菌(4株)、致病性大肠杆菌(7株)及双歧杆菌(3株)，由中国中医科学院西苑医院基础研究室提供。

　　1.1.5 鸡胚：9日龄，由中国农业科学院畜牧所提供。

　　1.1.6 试验用动物：KM种小鼠，二级，体重12～14 g，雌雄各半，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号：SCXK(京)2004-0001。

　　1.1.7 试剂：DMEM干粉，美国GIBCO产品(批号：12100-038)。胎牛血清，HyClone(批号：AJM11171)。胰蛋白酶，Tryptong 1:250(批号:20020705)。青霉素、链霉素用蒸馏水配制成浓度为10000u/mL的制剂。营养肉汤干粉，北京市海淀区微生物培养基制品厂产品(批号20050925);M-H液体培养基干粉，中国卫生部药品生物制品检定所产品(批号20050827)，用于抑菌试验。以上两种干粉按照使用说明制成培养基后放冰箱备用。5%马血清肉汤：上述两种培养基中加入灭活的无菌马血清至5%浓度，用于甲和乙型链球菌的培养和抑菌试验。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 对FM1病毒感染小鼠肺指数及肺指数抑制率的测定试验：健康小鼠84只，随机分7组，即正常对照(给水)、病毒对照(给水)、双黄连口服液(14g/kg·日)、利巴韦林(0.07g/kg·日)组及受试药大(25g/kg·日)、中(12.5g/kg·日)、小(6.25g/kg·日)剂量组，每组12只，雌雄各半。各组动物自感染前二天至感染后第五天，分别灌胃给药或给水共6天。除正常组外，各组小鼠均在乙醚轻度麻醉下，分别以10LD50的FM1病毒50 μL滴鼻感染，正常对照组同法滴生理盐水50 μL。末次给药后24 h将小鼠称重后摘眼球放血致死，通过无菌操作取出全肺称重，计算肺指数及肺指数抑制率。

　　1.2.2 对FM1病毒感染小鼠延长生命及降低死亡率作用试验：取健康小鼠随机分7个组(每组20只)即正常对照、病毒对照、双黄连口服液、利巴韦林组及受试药大、中、小剂量组。给药方法同“1.2.1”试验法，除正常对照组外，各组小鼠分别以5LD50的FM1病毒滴鼻感染后逐日观察动物发病情况并记录死亡数，共14天，计算死亡降低率和生命延长率。

　　1.2.3 药物对MDCK细胞的毒性试验：将稀释好的药物接入长成单层细胞的96培养孔中(0.1mL/孔)，置培养箱(5%CO2 、37℃)培养，每日观察细胞变化，计算半数有毒浓度和最大无毒浓度[1]。

　　半数毒性浓度(LD50) =Antilog(log>50%药物浓度) +

　　>50%死亡浓度百分率 – 50

　　>50%死亡浓度百分率 – <50%死亡浓度百分率×log稀释倍数

　　1.2.4 药物对流感甲3型、乙型病毒的直接杀伤试验：将稀释好的药物与病毒(100倍TCID50，下同)等量混合后置37℃温箱作用1 h。然后接入长成单层细胞的96孔培养孔中(每孔0.2mL)，置37℃环境中吸附1 h。用维持液洗两次后加入维持液(0.1mL/孔)。培养箱(5%CO2、 37℃)培养，每日观察细胞病变(CPE)情况，当病毒对照出现++++时，终止试验，计算半数中和浓度[1]和中和指数。

　　半数中和浓度=Antilog(log <50%药物浓度) +

　　50 –<50%抑制百分率>50%抑制百分率 – <50%抑制百分率

　　×log稀释倍数

　　中和指数= 半数毒性浓度 半数中和浓度

　　注：细胞病变 + 为25%，++ 为50%，+++ 为75%，++++ 为100%.

　　1.2.5 药物对MDCK细胞内流感甲3型、乙型病毒繁殖的抑制试验：将稀释好的病毒接入细胞孔中(每孔0.1mL)置37℃环境中吸附1h，用维持液洗两次后分别加入含不同药物浓度的维持液(96孔板，0.1mL/孔)， 培养箱(5%CO2、 37℃)培养，每日观察CPE情况，当病毒对照孔出现++++时，终止试验，计算半数保护浓度[1]和治疗指数。

　　半数保护浓度=Antilog(log <50%药物浓度) +

　　50 –<50%抑制百分率>50%抑制百分率 – <50%抑制百分率×log稀释倍数

　　治疗指数= 半数毒性浓度 半数保护浓度

　　以上试验同时设药物对照组、病毒对照组、细胞对照组，每试验组设4孔细胞，重复试验两次。

　　1.2.6 药物对致病菌的抑制试验：将生药浓度为0.1 g生药/mL的青鹏胶囊提取液用M-H培养基稀释成含生药100、50、25、12.5、6.25、3.125及1.56 mg/mL浓度的药液，将各浓度的药液分别依次加入已备好的无菌小试管(各1mL)，共40排，最后1排为不加细菌的药物对照品。

　　将1∶1000稀释的新鲜的细菌培养物加入到上述各排稀释好的含药试管中(0.1mL/管)，另设不加药的各菌株对照管。所有试管置37℃培养箱内培养20～48 h后观察结果。无细菌生长的最小稀释度的药物浓度即为最小抑菌浓度(MIC)。

　　1.3 统计学处理方法

　　实验数据以均数±标准差(x±S)表示，采用SPSS11.5统计软件处理。计量比较用方差分析，计数比较用卡方检验，显著性检验水准α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 小鼠肺指数及肺指数抑制率测定结果(表1)表1小鼠肺指数及肺指数抑制率测定结果注：与正常对照组相比a P<0.05，与模型对照组相比b P<0.05，与利巴韦林组相比c P<0.05，与双黄连口服液组相比d P<0.05.

　　表1显示，与正常组比较模型组病毒感染小鼠肺指数抑制率具有显著性差异(P<0.05)。青鹏胶囊大、中、小剂量组肺指数明显降低(P<0.05)，肺指数抑制率为20.99%～30.25%。

　　2.2 病毒感染小鼠死亡率和生命延长试验结果(表2～3)表2病毒感染小鼠死亡率统计注：与正常对照组相比a P<0.05，与模型对照组相比b P<0.05，与利巴韦林组相比c P<0.05.表3病毒感染小鼠生命延长时间及延长率统计注：与正常对照组相比a P<0.05，与模型对照组相比b P<0.05，与利巴韦林组相比c P<0.05.

　　表2～3显示，病毒感染除利巴韦林组外其他各组小鼠均有死亡，模型对照组平均生存时间为8.6±3.20天。中剂量组与模型对照组比较有显著差异(P<0.05)。

　　2.3 药物对细胞毒性试验结果

　　取青鹏胶囊水提取液做25.0 mg生药/mL……12.5 mg生药/mL……0.781 mg生药/mL 6个递倍稀释浓度，每个浓度做4个平行样进行实验。实验测得青鹏胶囊半数毒性浓度为1.105 mg生药/mL，最大无毒浓度为0.781 mg生药/mL;重复第二次实验，由于第一次实验药物浓度偏大，调整药物浓度，做3.125 mg生药/mL……1.562 mg生药/mL……0.098 mg生药/mL 6个递倍稀释浓度，每个浓度做4个平行样进行实验。第二次实验测得青鹏胶囊半数毒性浓度为1.105 mg生药/mL，最大无毒浓度为0.781 mg生药/mL。对两次实验结果平均得青鹏胶囊平均半数毒性浓度为1.105 mg生药/mL，平均最大无毒浓度为0.781 mg生药/mL。同法测得双黄连口服液平均半数毒性浓度为0.83 mg生药/mL，平均最大无毒浓度为0.586 mg生药/mL;利巴韦林注射液平均半数毒性浓度为0.58 mg生药/mL，平均最大无毒浓度为0.058 mg生药/mL。

　　当青鹏胶囊为0.781 mg生药/mL、双黄连为0.59 mg生药/mL、利巴韦林为0.058 mg生药/mL浓度时对MDCK细胞无毒性，为最大无毒浓度。

　　2.4 药物对流感甲3型、乙型病毒的直接杀伤作用结果

　　取青鹏胶囊水提取液做1.5625 mg生药/mL……0.781 mg生药/mL……0.049 mg生药/mL 6个递倍稀释浓度，每个浓度做4个平行样进行实验。实验测得青鹏胶囊对流感甲3型病毒半数中和浓度为0.391 mg生药/mL，代入公式求得对流感甲3型病毒中和指数为2.83;以同样浓度同样方法重复第二次实验，第二次实验测得青鹏胶囊对流感甲3型病毒半数中和浓度为0.552 mg生药/mL，代入公式求得对流感甲3型病毒中和指数为2.00。对两次实验结果平均得青鹏胶囊对流感甲3型病毒平均半数中和浓度为0.472 mg生药/mL，平均中和指数为2.42。同法测得双黄连口服液对流感甲3型病毒平均半数中和浓度为0.374 mg生药/mL，平均中和指数为2.88;利巴韦林注射液对流感甲3型病毒平均半数中和浓度为0.069 mg生药/mL，平均中和指数为13.13。

　　同样方法测三种药物对流感乙型病毒的直接杀伤作用。测得三种药物对流感乙型病毒均无直接杀伤作用。

　　2.5 药物对流感甲3型、乙型病毒的治疗作用结果

　　取青鹏胶囊水提取液做0.781 mg生药/mL……0.391 mg生药/mL……0.024 mg生药/mL 6个递倍稀释浓度，每个浓度做4个平行样进行实验。实验测得青鹏胶囊对流感甲3型病毒半数保护浓度为0.078 mg生药/mL，代入公式求得对流感甲3型病毒治疗指数为14.17;以同样浓度同样方法重复第二次实验，第二次实验测得青鹏胶囊对流感甲3型病毒半数保护浓度为0.078 mg生药/mL，代入公式求得对流感甲3型病毒治疗指数为14.17。对两次实验结果平均得青鹏胶囊对流感甲3型病毒平均半数保护浓度为0.078 mg生药/mL，平均治疗指数为14.17。同法测得双黄连口服液对流感甲3型病毒平均半数保护浓度为0.153 mg生药/mL，平均治疗指数为5.40;利巴韦林注射液对流感甲3型病毒平均半数保护浓度为0.0042 mg生药/mL，平均治疗指数为235.36。

　　同样方法测三种药物对流感乙型病毒的治疗作用。测得青鹏胶囊、双黄连口服液两种药物对流感乙型病毒无治疗作用;利巴韦林注射液对流感乙型病毒平均半数保护浓度为0.0043 mg生药/mL，平均治疗指数为212.62。

　　2.6 药物对致病菌的体外抑制作用结果(表4)

　　试验用各菌株在相应的培养基中生长良好,含药的培养基均无细菌生长。

　　表4显示，所用的51株菌株中青鹏胶囊提取液对金黄色葡萄球菌(10/10)、表皮葡萄球菌(10/10)、甲型链球菌(2/6)、乙型链球菌(5/5)、双歧杆菌(2/3)、肺炎杆菌(6/6)、绿脓杆菌(3/4)、致病性大肠杆菌(7/7)等革兰氏阳性球菌、阴性杆菌抑菌作用较好，其多数菌株的最低抑菌浓度在(6.25～100)mg /mL之间。尤其对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎杆菌、致病性大肠杆菌的多数菌株抑菌效果明显。表4青鹏胶囊对常见致病菌的抑菌作用注：表内数字指菌株数，MIC50 指抑制50%菌株所需抗生素最低抑菌浓度.

　　3 讨论

　　本实验应用流感病毒在细胞内生长繁殖的生物学特性，用不同的试验方法对青鹏胶囊进行抑制流行性感冒病毒实验。实验结果显示，青鹏胶囊对流感甲3型病毒的半数保护浓度和半数中和浓度分别为0.078 mg生药/mL和0.472 mg生药/mL，平均治疗指数和中和指数分别为14.17和2.42，但对流感乙型病毒没有抑制作用。青鹏胶囊按不同剂量灌胃给感染流感病毒FM1的小鼠，结果显示，该药中剂量组能降低感染动物的死亡率(P<0.05)，延长生存时间(P<0.05)，大、中、小剂量组肺指数与模型组比较差异非常显著(P<0.05)，肺指数抑制率为20.99%～30.25%，说明该药在小鼠体内能抑制FM1病毒复制，减轻肺部病变。此外用试管液体稀释法测定青鹏胶囊提取液对51株常见致病菌的抑制生长作用，结果显示,该药对金黄色葡萄球菌(10/10)、表皮葡萄球菌(10/10)、甲型链球菌(2/6)、乙型链球菌(5/5)、双歧杆菌(2/3)、肺炎杆菌(6/6)、绿脓杆菌(3/4)、致病性大肠杆菌(7/7)等革兰氏阳性球菌、阴性杆菌抑菌作用较强。

　　前期研究结果已证实青鹏胶囊具有明显的解热镇痛作用[3],能明显增加由于皮下注射环磷酰胺导致的小鼠白细胞减少以及胸腺和脾脏指数的下降，并能增强巨噬细胞吞噬功能，对特异性免疫和非特异性免疫功能均有一定的增强作用[4];此外还具有一定的抑菌作用。结合本次实验研究结果说明青鹏胶囊可从解热镇痛、免疫调节、抑菌及抗病毒等多方面对抗流行性感冒发挥其协同治疗作用。该项研究为青鹏胶囊治疗流行性感冒提供了实验依据。

　　【参考文献】

　　[1] 中国医学科学院流行病防治研究所编.常见病毒实验技术[M].北京：科学出版社 1978：20

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　　[3] 陈秋红，周小梅，多杰，等.青鹏胶囊解热镇痛及抗炎作用实验研究[J].山东中医杂志，2006，25(6)：407

　　[4] 周小梅，杨全余，陈秋红.藏药青鹏胶囊的免疫调节及体外抑菌作用实验研究[J].中成药杂志，2006，28(12):1821

　　[5]卫生部药政局编. 新药(西药)临床前研究指导原则汇编(药学、药理学、毒理学). 1993：143