低压缺氧对大鼠全脑缺血/再灌注后海马CA1区GLT1表达的影响

　　【摘要】 目的 探讨低压缺氧预处理对大鼠全脑缺血/再灌注后的神经保护作用。方法 将Wistar大鼠随机分为假手术组、低压缺氧对照组、全脑缺血/再灌注组、低压缺氧预处理+全脑缺血/再灌注组。间断暴露于低压缺氧(大气压为70.66～70.93kp)环境的大鼠[(1次/d)×4d ]作为低压缺氧对照组。采用Pulsinelli四血管闭塞法复制大鼠全脑缺血/再灌注模型，夹闭颈总动脉造成全脑缺血8min后再灌注。硫堇染色观察大鼠海马组织学改变;免疫组织化学方法观察神经胶质细胞谷氨酸转运体亚型1阳性细胞表达变化，并将四组结果进行比较。结果 Wistar大鼠低压缺氧预处理全脑缺血/再灌注组海马CA1区存活细胞数较全脑缺血/再灌注组明显增加，其神经胶质细胞谷氨酸转运体亚型1阳性细胞表达量较全脑缺血/再灌注组显著升高。结论 低压缺氧可通过上调神经胶质细胞谷氨酸转运体亚型1的表达，减少神经细胞的死亡，发挥神经保护作用。

　　【关键词】全脑缺血再灌注;低压缺氧;神经保护;免疫组化

　　EFFECT OF HYPOBARIC HYPOXIA PRECONDITIONINGON THE EXPRESSION OF GLT1 OF HIPPOCAMPAL

　　CA1 SUBFIELD OF RATS WITH GLOBAL

　　CEREBRAL ISCHEMIA REPERFUSION

　　Wu Qiong1, Liu Yongnian1, Guo Xinqin2

　　(1.Department of Pathophysiology,Qinghai University Medical College;2.Heze Medical College)

　　Abstract Objective To study the neural protection of Hypobaric Hypoxia Preconditioning (HHP) after global cerebral ischemia and reperfusion.Methods The Wistar rats were randomly divided into sham group，HHP control group，global cerebral ischemia and reperfusion group(IR)and HHP+IR group.HHP control group was explored environment with intermittent( 70.66～70.93kp，1time/d×4d).Global cerebral ischemia was performed by four vessels occlusion in rats.We observed the changes of hippocampus neurons with thionin staining and expression of GLT1 on hippocampal CA1 subfield with immunohistochemistry staining ,then the data analyzed with SPSS software.Results The quantity of the surviving cells in CA1 region of hippocampus increased in the group of HHP+IR than that of IR group ，the expression of GLT1 on the CA1 subfield hippocampus significantly increased compared with IR group. Conclusion Hypobaric Hypoxia Preconditioning might selectively increase the expression of GLT1 and reduce the number of death cells of global cerebral ischemia and reperfusion .It is considered that HHP plays an important role in the neural protective effect.

　　Key words Global cerebral ischemia and reperfusion Hypobaric hypoxia Neural protection Immunohistochemistry

　　低氧预处理 (hypoxic preconditioning , HP) 是指预先短时间非致死性重复缺血/缺氧后，机体组织细胞获得对随后长时间致死性缺血/缺氧损伤的高度耐受性处理[1]。预适应是机体抗缺氧或缺血的一种内源性保护现象，它不仅存在于多种动物的心脏，而且也存在于肝、肾和脑等多种器官、组织和细胞中[2～6]。近年来，脑低氧预适应研究成为神经科学界的热门课题。

　　本研究根据预适应的一般知识，结合缺氧预适应方面的有限资料，改良吕国蔚急性重复缺氧动物模型[7]，建立低压缺氧预适应(Hypobaric Hypoxia Preconditioning，HHP)动物模型，并采用Pulsinelli四血管阻断法[8]建立大鼠全脑缺血模型，观察低压缺氧对大鼠全脑缺血8min再灌注后海马CA1区神经元损伤的影响，初步探讨其保护机制。现将有关内容报告如下：

　　1 材料与方法

　　1.1 动物及分组

　　健康雄性Wistar大鼠48只，体重280～300g，由河北医科大学实验动物中心提供，在22～25℃实验室中饲养 2 d以适应实验室环境。大鼠随机分为4组，每组12只(6只用于硫堇染色，6只用于免疫组化)。①假手术组(Sham)行全脑缺血sham术，即只凝闭双侧椎动脉和暴露双侧颈总动脉，不夹闭颈总动脉。②低压低氧对照组(Control)于sham术前4d开始，暴露于低压(大气压为70.66～70.93kp)缺氧环境，每日1次，共4次，其他同sham组。③全脑缺血/再灌注组(IR)夹闭颈总动脉8 min后恢复血液再灌流，其他同sham组。④低压低氧预处理+全脑缺血/再灌注组(HHP+IR)暴露于大气压(70.66～70.93kp)减压缺氧，每日1次，共4次，然后进行全脑缺血/再灌注。

　　1.2 主要材料及试剂选择

　　免疫组化试剂盒(北京中杉生物工程公司产)，豚鼠抗大鼠GLT1多克隆抗体(Chemicon 公司产)，硫堇(美国Sigma公司)。

　　1.3 硫堇染色

　　再灌注7天后，动物麻醉断头取脑，冠状切取位于视交叉后1 mm至4 mm处的脑组织，将所取标本置于4%多聚甲醛固定液中固定48 h，石蜡包埋、切片(5 μm厚)，组织切片行硫堇(thionin)染色，Olympus光学显微镜下观片。

　　1.4 低氧预处理模型的建立

　　改良吕国蔚[7]急性重复缺氧模型法，建立低压缺氧预适应动物模型。将大鼠称重后放入含有新鲜空气、经过标定(2500ml密闭玻璃容器)的乏氧瓶内，用橡皮塞密闭(皮塞口连接减压装置及压强测定装置，以保证瓶内压强约为70.66～70.93kp)。瓶内水蒸气和二氧化碳分别用无水氯化钙及钠石灰充分吸收，计时，待出现喘呼吸后立即取出，每日1次，共4次。

　　1.5 大鼠全脑缺血/再灌注模型的建立

　　参照Pulsinelli[8]大鼠四血管闭塞法制造全脑缺血模型。具体方法如下：动物经腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉后行腹位固定，自双耳前缘连线中点向尾侧做约1.5 cm切口，分离颈旁肌暴露第一颈椎横突，寻找翼状孔，将预热的尖端直径约0.5 mm 的电烙针插入，凝闭双侧椎动脉。术后供以水、食，2 d后选用恢复良好的动物制作全脑缺血模型，首先在乙醚吸入麻醉下，游离双侧颈总动脉，待动物清醒后夹闭双侧颈总动脉8 min造成全脑缺血。夹闭颈总动脉期间，大鼠瞳孔散大，翻正反射消失，表明大鼠产生了全脑缺血。手术及全脑缺血过程中，创口局部施以局麻药(1%普鲁卡因)止痛;室温保持在20℃以上;用白炽灯照射动物以维持其肛温在37℃左右，直到恢复活动。全脑缺血后缝合创口，局部给予庆大霉素预防感染。

　　1.6 免疫组织化学染色

　　再灌注3天后，动物麻醉断头取脑，脑组织取材、固定、包埋、切片同硫堇染色取材制作过程，免疫组织化学具体染色方法如下：①切片经二甲苯及梯度酒精(100%～70%)脱蜡至水，在PBS(0. 01mol/L)中摇洗(3次×5min);②3%甲醇过氧化氢室温下孵育30 min，蒸馏水清洗(3次×5min), PBS(0. 01mol/L)摇洗(3次×5min);③10%血清工作液封闭抗原，37℃恒温水浴锅湿盒内孵育60 min;④滤纸吸取多余血清，加入豚鼠抗大鼠GLT1抗体(1:1500)，4℃冰箱过夜⑤PBS(0. 01mol/L)摇洗(3次×5min)，加入生物素化二抗IgG(羊抗豚鼠); 37℃恒温水浴锅湿盒内孵育60 min;⑥PBS(0. 01mol/L)中摇洗(3次×5min)，加入辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃恒温水浴锅湿盒内孵育50 min;⑦PBS(0. 01mol/L)中摇洗(3次×5min)，DAB显色，自来水充分冲洗，终止显色，梯度酒精脱水、二甲苯透明化、中性树胶封片。每例动物随机选取5张切片于光学显微镜下进行定性观察，并通过GLT1阳性颗粒包绕锥体神经元数目进行GLT1阳性细胞计数。

　　1.7 统计学处理

　　应用SPSS13.0软件进行统计分析。数据均以x±S表示，显著性检验采用方差分析和SNKq检验，显著性检验水准α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 脑缺血体征

　　4VO后大鼠先挣扎数秒，于30～60 s内昏迷，放开固定，可见大鼠四肢上举，翻正反射消失，痛觉反应消失，双侧瞳孔散大，眼球呈灰白色，身体可呈角弓反张。呼吸先加快，然后恢复正常，部分动物可有呼吸暂停现象，证明全脑缺血模型有效建立，模型组与sham组有明显的区别。

　　2.2 组织学改变特征

　　Sham组大鼠海马CA1区锥体细胞排列整齐，无细胞缺失，细胞形态完整，胞核大而圆，位于细胞中央，核仁清晰，尼氏体丰富(Fig. 1A)。Control组大鼠海马CA1区组织形态与sham组基本一致，但出现个别锥体细胞水肿及细胞间隙增宽的现象(Fig. 1B)。IR组可见明显的组织损伤，表现为海马CA1区锥体细胞稀疏，排列紊乱;残存的锥体细胞体积缩小，呈三角形或不规则形;核膜不完整，染色质碎裂，核仁消失;其周围可见大量细胞碎片(Fig. 1C)。HHP+IR组与全脑缺血组相比，细胞数量明显增加，细胞形态基本正常，但存在部分细胞排列紊乱的情况(Fig. 1D，Tab 1)。

　　2.3 免疫组化特征

　　GLT1阳性标记物呈棕黄色，大量表达于海马的星形胶质细胞的胞浆及胞膜，少量表达于锥体神经元的胞膜。Sham组大鼠海马CA1区可见到一定量GLT1阳性标记物，其染色较浅，表达分散，面积小，锥体神经元细胞间未见明显GLT1的阳性颗粒(Fig. 2A)。Control组可见GLT1阳性标记物广泛分布于海马CA1区，尤其在锥体细胞层广泛分布(Fig. 2B)。全脑缺血组(IR)在锥体细胞层及其周围可见大片的GLT1表达缺失区域(Fig. 2C)。而HHP+IR组(Fig. 2D)于全脑缺血后可见大量GLT1阳性标记物广泛分布于海马CA1区，尤其在锥体细胞层可见大量、深染的GLT1阳性颗粒包绕锥体神经元细胞，与全脑缺血组相比，GLT1阳性细胞表达量明显升高(Tab 1)。表1硫堇染色及GLT1阳性细胞计数结果注*与Sham组比较, P<0. 05;△与Control组比较, P<0. 05;▲与IR组比较, P<0. 05.

　　3 讨论

　　GLT1维持细胞外液谷氨酸浓度处于正常水平，从而防止其兴奋性毒性作用方面发挥重要作用。近年研究[9]表明上调神经胶质细胞GLT1的表达可对大鼠全脑缺血模型发挥明显的神经保护作用。Vemuganti[10]和Rao[11，12]等研究表明，利用反义寡核苷酸对GLT1进行打击，可以扩大局限性缺血引起的脑梗死面积，加重神经元的损伤。另有研究表明，在脑缺血后神经细胞死亡之前，GLT1mRNA的表达水平即已经显著下降，说明GLT1表达的减少参与了神经细胞损伤过程[13]。综上所述，GLT1在终止谷氨酸能神经传递，维持细胞外液谷氨酸浓度处于正常水平方面发挥着重要作用[14]。

　　海马是边缘系统的重要组成部分。在应激反应中，海马是介导应激反应的最重要的脑区之一[15] 。特别是CA1区神经元，对缺血缺氧最为敏感[16]，易受缺血、缺氧损伤，其锥体细胞延迟性死亡的数目常被作为判断脑缺血损伤严重程度的标志之一，加之海马易于从脑组织中分离出来，其结构特征明显，易于识别，所以我们选择该脑区作为脑缺血/再灌注的研究部位。

　　本实验结果显示，HHP对照组大鼠海马CA1区组织形态与sham组基本一致，但出现个别锥体细胞水肿及细胞间隙增宽的现象，说明减压缺氧这种方式并未对大鼠海马神经元造成显著损伤。IR组海马CA1区出现明显损伤性改变，神经元密度下降，发生明显的锥体神经元迟发性死亡。HHP+IR组与IR组相比，细胞形态基本正常、细胞数量相对较多，说明经过低压缺氧预处理可以减少大鼠全脑缺血8min再灌注后间隔7d的延迟性神经元死亡，明显提高海马CA1区存活神经元数量。

　　应用免疫组化检测发现HHP+IR组于全脑缺血后可见大量GLT1阳性标记物广泛分布于海马CA1区，与全脑缺血组相比，GLT1阳性细胞数明显升高。GLT1这种表达变化的结果表明，低压低氧能通过上调GLT1来发挥对抗大鼠全脑缺血的神经保护机制。

　　另外通过实验我们发现，低压低氧须经过一段时间才能通过提高GLT1的表达来发挥对神经元的保护作用，因此其很难应用于急性脑缺血的治疗，但是我们仍可通过低压低氧使机体产生缺血耐受性，将其应用于颈动脉内膜剥离术、心肺分流术、心肺转流术等发生脑缺血危险几率高的择期手术。

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