IL1β对血管平滑肌细胞Cathepsin S的表达影响

　　【摘要】 目的 探讨体外情况下IL1β对血管平滑肌细胞组织蛋白酶S(Cathepsin S,CatS)的表达影响。方法 原代培养小鼠主动脉平滑肌细胞(VSMC)传代后用IL1β(10ng/ml)诱导细胞12、24、36h，免疫荧光(Immunofluorescence, IMF)法检测VSMC CatS的表达变化，ELISA试剂盒检测细胞培养基CatS浓度。结果 原代培养的细胞 VSMCαactin呈阳性，细胞纯度达96%以上。CatS免疫荧光染色，对照组呈阴性， IL1β组均为阳性，并随着诱导时间的延长荧光强度不断增强。对照组培养基CatS浓度微量，经 IL1β诱导12 h后明显增加，与对照组相比差异显著(P<0.01), 24 h后达到高峰并趋于稳定。结论 炎性细胞因子IL1β在体外可促进VSMC表达、分泌组织蛋白酶CatS。

　　【关键词】 IL1β VSMC CatS 动脉粥样硬化

　　EFFECTS OF IL1β ON EXPRESSION OFCATHEPSIN S IN VSMC

　　Wu Jianfang

　　(Dept. of Laboratory Diagnosis, Qinghai University Medical College)

　　Abstract Objective To study the influence of IL1β on expression of Cathepsin S in VSMC in vitro. Methods Mouse VSMC was cultured by primary methods. After passage culture， to incubate VSMC with IL1β (10ng/ml) for 12h, 24h, 36h; then detect the CatS expression in VSMC by IMF and test the concentration of CatS in medium by ELLISA methods. Results IMF showed that primary culture cells have positive VSMC actin staining and the cell purity was more than 96%. CatS showed negative immunofluorescence staining in control VSMC but positive staining in VSMC induced with IL1β and the staining intensity grown up following the induced time last. The CatS concentration in medium increased clearly after VSMC induced by IL1β for 12h and reached the peak after 24h then keeping this level. The change has significant statistic difference(P<0.01).Conclusion IL1β can induce VSMC to express CatS in vitro.

　　Key words IL1β VSMC CatS

　　动脉粥样硬化被认为是动脉壁血管重塑的炎性病理过程。炎性因子如IL1β、IFNγ可促进内皮细胞、血管平滑肌细胞等细胞表达与分泌基质金属蛋白酶,导致纤维帽内基质形成与降解失衡,引起纤维帽破裂或影响斑块的稳定性。然而随着研究的深入，国外研究者发现，易损性斑块区组织蛋白酶亦呈高表达，该酶具有胶原及弹性蛋白降解活性，表明组织蛋白酶在动脉硬化的发生、发展及斑块不稳定性中起着重要作用，那么在体外炎性细胞因子是否也能促进内皮细胞、血管平滑肌细胞等分泌组织蛋白酶呢?我们通过IL1β体外诱导大鼠血管平滑肌细胞VSMC后CatS的表达变化来进行证实。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂与仪器

　　DMEM培养基、胎牛血清(Gibco公司);Collagenase TypeⅡ、抗VSMCαactin 、CY2 荧光标记纯化山羊抗鼠IgG、CatS免疫荧光试剂盒、IL1β、ELISA测定试剂盒(上海生工生物制品公司);酶标仪(ELX800,American)，解剖显微镜(Paxcam,American);荧光显微镜(LEICA DMI6000B,Germany)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 VSMC原代培养：常规麻醉、消毒小鼠，暴露心脏，注射器穿刺左心室，PBS缓冲液冲洗动脉后完整分离胸、腹主动脉，解剖显微镜下撕去血管外膜至血管光滑透明，超净工作台下将血管快速剪成1～2 mm2 大小，用CollagenaseTypeⅡ消化后离心，再用1 ml新鲜DMEM培养基(添加10%胎牛血清)重悬细胞，接种于12孔培养板中的一孔，常规静置培养。第7～8天细胞生长基本达培养板面积的80%左右，可传代，常规方法即可。

　　1.2.2 细胞鉴定：取对数生长期细胞常规接种于培养载玻片，24 h后取出载玻片常规冲洗、固定、10%山羊血清封闭非特异性抗原，VSMCαactin室温下孵育细胞2 h，PBS 缓冲液洗涤3次。以下步骤避光：用荧光标记二抗室温下孵育细胞1h，PBS 缓冲液洗涤3次，5 min/次，然后用荧光封片剂封片后在荧光显微镜下检测。

　　1.2.3 细胞CatS检测：取对数生长期细胞，接种于置有载玻片的培养皿，24 h后实验组加入IL1β(10ng/ml)，对照组加DMEM培养基，分别孵育12、24、36 h后终止培养，取出载玻片，按试剂盒说明进行免疫荧光染色，用荧光显微镜检测细胞CatS表达情况。

　　1.2.4 培养基CatS检测：取对数生长期细胞按2.5×105个/ml接种于25 cm2培养瓶内，48 h后换液，实验组加入IL1β(10ng/ml)，对照组加DMEM培养基，分别孵育12、24、36 h后终止培养，收集细胞培养基，用ELISA试剂盒检测CatS浓度。

　　1.3 统计学方法

　　统计数据用SPSS13.0统计软件完成。实验数据以x±SD表示，不同时间组比较先做方差分析，当P<0.05时，作两两比较;试验组与对照组比较采用t检验。

　　2 结果

　　2.1 原代培养

　　细胞于第2天游离出，第3天沿细胞团成放射状生长，传代后细胞生长较快，成典型的峰谷样生长，细胞形态多呈宽大的长梭形，核大。

　　2.2 细胞鉴定

　　原代培养细胞 VSMCαactin荧光染色呈阳性， 绿色荧光为束状，显示肌丝特征，证实为平滑肌细胞。流式细胞仪检测细胞纯度达96%以上。

　　2.3 细胞CatS检测

　　对照组VSMC CatS荧光染色呈阴性，说明正常情况下VSMC无CatS表达，IL1β组染色均为阳性，并随着IL1β诱导时间的延长，VSMC CatS的荧光强度不断增强 (见图1)。

　　2.4 培养基CatS检测

　　表1IL1β(10ng/ml)诱导VSMC不同时间后CatS检测结果 注：与对照组相比# P<0.05，##P<0.01，同组前后时间段相比*P<0.05，**P<0.01.

　　对照组培养基CatS浓度微量， 实验组IL1β诱导VSMC 12 h后，CatS浓度即有明显增加，与对照组相比差异显著(P<0.01), 24 h后CatS浓度达到高峰并趋于稳定(见表1、图2)。

　　3 讨论

　　动脉粥样硬化被认为是动脉壁血管重塑的炎性病理过程。基质金属蛋白酶(MMPs)参与此病理过程，使纤维帽内基质形成和降解失衡,导致纤维帽破裂或影响斑块的稳定性[1～4]。然而随着研究的深入，人们发现炎症介质的刺激可促进VSMC分泌组织蛋白酶S及K等，使得这类具有弹性组织解离特性的半胱氨酸蛋白酶在动脉弹力蛋白损伤处过度表达[5]。表明组织蛋白酶Cat在动脉硬化的发生、发展及斑块不稳定性中也起着一定作用。

　　Cat是一类在酸性pH值环境中被活化的溶酶体蛋白酶，属于木瓜蛋白酶，人类Cat包括:Cat B、C、D、F、H、K、L、O、S、V、W和X，主要在胎盘表达，大部分是半胧氨酸蛋白酶，其余是天冬氨酸或丝氨酸蛋白酶，能够降解多种细胞外基质成分如弹性蛋白、胶原纤维等，参与机体的多种生理活动及许多疾病的发生发展[6]。利用免疫杂交方法证实在动脉粥样硬化的平滑肌等细胞中含有大量的免疫反应性CatS和CatK，而其内源性抑制剂Cystatin C却呈低表达，较正常组织比，人体动脉硬化组织提取物有较大的弹性溶解作用，Cat抑制剂E64可限制此弹性蛋白的溶解，表明在动脉粥样斑块形成中，CatS、K对弹性蛋白溶解的重要作用。另外在氧化修饰低密度脂蛋白的刺激下，巨噬细胞表达CatS增加，炎性细胞因子白介素l、干扰素可促使巨噬细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞对CatS的分泌与表达增加，从而增加对细胞外弹性蛋白与胶原的降解，易于平滑肌细胞的迁移和增殖。CatS/或E64高表达小鼠，其弹性蛋白及胶原溶解活性明显降低，证实 CatS参与早期白细胞的游走、中弹性层粘蛋白的降解、内皮细胞的迁移以及新生血管的形成等过程[7～10] 。以上均提示组织蛋白酶S、K在血管重塑与动脉硬化斑块形成中的重要作用。那么在体外情况下炎性细胞因子是否也能刺激血管平滑肌细胞分泌组织蛋白酶呢?在实验中我们证实了这一点：用IL1β诱导大鼠VSMC，随着诱导时间的延长，VSMC CatS的荧光强度不断增强，而且培养基中CatS的浓度在诱导12h后有明显增加，与对照组相比差异显著(P<0.01), 24 h后CatS浓度进一步升高并趋于稳定。

　　由此我们发现，炎性细胞因子不仅在体内通过促使巨噬细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞分泌组织蛋白酶参与了动脉粥样硬化的发生发展及斑块破裂的形成过程，在体外也能刺激血管平滑肌细胞分泌CatS，但CatS在体外是否也具有较强的弹性蛋白与胶原降解作用，我们还需进一步开展研究。

　　【参考文献】

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