白藜芦醇和三甲基白藜芦醇对豚鼠心室肌细胞钠电流的作用

　　作者：杜景霞1，李 艳1，王建刚1，路西明1，金满文2　 作者单位：1.河南科技大学医学院，河南洛阳 471000　2.华中科技大学同济医学院，湖北武汉 430030

　　【摘要】 目的研究反式白藜芦醇(RES)和反式3，5，4’-三甲基白藜芦醇(3,5,4’-Trimethoxystilbene，TMS)对豚鼠心室肌细胞钠电流(INa)的直接作用，探讨其心肌保护机制并比较其作用强弱。方法 用全细胞膜片钳技术记录RES 和TMS对豚鼠单个心室肌细胞INa的作用。结果 RES(10，30，100 μmol/L)浓度依赖性的抑制豚鼠心室肌细胞INa，其中30 μmol对INa的抑制率为(17.3±3.1)%(P<0.005)，而100 μmol对其抑制率为(52.7±10.2)%(P<0.01);TMS(10μmol)对其抑制率(36.8±5.6)%(P<0.005)，作用迅速，用药后3 min左右即开始起效，洗脱后均可以完全恢复，1、3 μmol/L TMS未影响INa大小。结论 RES和TMS均可浓度依赖性的抑制豚鼠心室肌细胞INa，作用快、可逆，且TMS作用强于RES。

　　【关键词】 反式白藜芦醇;反式3，5，4’-三甲基白藜芦醇;心室肌细胞;钠电流

　　Effects of Resveratrol and 3,5,4’trimethoxystilbene on Sodium Currentin Guinea Pig Ventricular Myocytes

　　DU Jingxia，LI Yan，WANG Jiangang，et al

　　(Medical College，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471000, China)

　　Abstract:Objective To investigate the effects of resveratrol (RES) and its derivative 3,5,4’Trimethoxystilbene (TMS) on sodium current(INa) in guinea pig ventricular myocytes, and to observe if they exerted direct actions on the heart，and to compare the effect size of them.Methods Single cardiac myocytes were isolated by enzyme, and the effects were assessed by applying wholecell patch clamp technique.Results RES(10，30，100μmol/L)was shown to inhibit INa of guinea pig ventricular myocytes in a concentration dependent manner, and the inhibition ratio of 30，100 μmol/L was (17.3±3.1)%(P<0.005)and (52.7±10.2)%(P<0.01), respectively. TMS(10 μmol/L)was also shown to inhibit INa of guinea pig ventricular myocytes and the inhibition ratio was (36.8±5.6)%(P<0.005), while 1, 3 μmol/L had no effects. The two drugs acted quickly (about 3 min) and their effects were reversible completely after a 10min washout.Conclusion RES and TMS can exhibit direct inhibitory effects on INa in guinea pig ventricular myocytes and act rapidly, and in addition, the effect of TMS is stronger than RES.

　　Key words:resveratrol; 3, 5, 4’trimethoxystilbene; ventricular myocytes; sodium current

　　白藜芦醇(RES)是一种非黄酮类多酚化合物，化学名为3 , 5，4’三羟基反二苯代乙烯(3，5，4’trihydroxystilbene)。天然的RES存在于葡萄皮、花生及中药虎杖等72种植物中，是一种植物抗毒素，在恶劣环境或是在植物受到霉菌感染时产生[1]。红葡萄酒可以显著降低心脑血管病发生率，使人们对红葡萄酒中的多酚类物质进行了广泛而深入的研究。目前越来越多的学者认为，RES是红葡萄酒中发挥心血管保护作用的主要功能因子。研究证实，RES能够比红葡萄酒中的其他多酚类物质具有更强的心血管保护作用[2]，包括抗氧化、抑制血小板聚集、增加eNOS和nNOS的表达并提高其活性、舒张血管、抗血管平滑肌细胞增殖、抑制血管紧张素II引起的心肌细胞肥大、抗心律失常等作用[3-7]。也有报道RES对豚鼠心室肌细胞钙电流的快速抑制作用[8]。三甲基白藜芦醇(TMS)是RES的衍生物，研究发现TMS也具有类似于RES的一些药理作用，如抗血管增殖[9]、抗炎抗过敏[10]、抗肿瘤[11]等作用。鉴于RES和TMS在化学结构和药理作用上的相似性，TMS可能更具应用前景。本研究探讨RES对豚鼠心室肌细胞INa是否有直接的作用，并观察TMS是否也具有和RES相似的作用，并比较其作用强弱，进一步探讨其心肌保护机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 溶液和试剂 Tyrode液成分(mmol/L)：NaCl 135，KCl 5.4，CaCl2 1.8，MgCl2 1.0，NaH2PO4 0.33，Glucose 10.0，HEPES 10.0，用NaOH 调节pH至7.3。无钙台氏液为Tyrode液中去掉CaCl2。记录INa的电极外液(mmol/L)：NaCl 5.0，CholineCl 120.0，CsCl 20.0，MgCl2 1.0，HEPES 5.0，CaCl2 1.0，Glucose 10.0，用CsOH 调节pH 至7.3，加入100 μmol/L CdCl2阻断Ca2+电流。记录INa的电极内液(mmol/L)：NaCl 5.0，CsCl 110.0，CsF 20.0，MgCl2 2.5，CsEGTA 5.0，HEPES 5.0，MgATP 5.0，GTP 0.1，用CsOH 调节pH至7.3。保存细胞用的KB液成分(mmol/L)：KCl 10.0，KH2PO4 10.0，Glucose 20.0，HEPES 10.0，Taurine 10.0，MgSO4 1.8，Potassium glutamate 120.0，EGTA 0.5，用KOH调节pH 至7.2。RES从湖南洪江华光生物有限责任公司购进，纯度99.11%。TMS由华中科技大学同济医学院食品药品评价中心合成，纯化分离，纯度99.9%。临用前均用二甲基亚砜(DMSO)溶解，分别配置成储备液浓度为0.1 mol/L和0.01 mol/L，-20℃避光保存。临用前稀释至少1 000倍。胶原酶II型和蛋白酶E购自Worthington公司。HEPES，BSA，EGTA，cholineCl，Taurine，MgATP，GTP均为Sigma公司产品。其余药品为国产分析纯。

　　1.2 豚鼠心室肌细胞分离 采用酶解法制备单个心室肌细胞。体质量280～330 g的豚鼠，雌雄不拘，经20%氨基甲酸乙酯(120 mg/kg)腹腔麻醉后行气管插管，开胸，下腔静脉给予肝素500 U/kg，分离主动脉并插管，肺动脉减压，迅速取下心脏在37℃恒温和供氧(100%O2)条件下行Langendorff灌流(主动脉压70 cm 水柱)。先以Tyrode液灌流3 min，再以无钙台氏液冲洗3 min后，用含II型胶原酶10.5 mg，蛋白酶E 1.05 mg，BSA 25 mg的无钙台氏液25 mL循环灌流35～40 min，取下心脏，除去心房，取一小块左室心肌，稍剪后置于KB液中轻轻吹打至细胞分离，即得到分离的单个心室肌细胞。细胞放于4℃保存，静置1～2 h后用于实验。

　　1.3 全细胞膜片钳记录 采用全细胞膜片钳记录方法，在电压钳制下记录心室肌细胞INa。吸取细胞保存液数滴，加入1 mL细胞池内，待细胞沉底贴壁后，用细胞外液灌流，直至实验结束停止灌注。在倒置显微镜下选择横纹清晰无颗粒感，膜光滑完整，立体感强的杆状静止细胞为实验对象。INa记录在20℃左右完成。玻璃毛坯(外径1.5 mm，南京泉水教学实验器材厂)，经微电极拉制仪(Sutter，Japan)两步拉制后，尾端注射充灌电极内液。将电极固定于电极把持器上，通过把持器侧面吸管给予电极尖端一定正压并使其进入液面，入水电阻为1.0 MΩ左右。补偿液接电位后，调节三维操纵器并用微调将电极尖端移向细胞表面，放掉正压，轻施负压进行封接，使封接电阻达1 GΩ以上，即形成高阻封接。补偿CFast后，继续施加脉动负压穿破膜片形成全细胞记录模式。钳制电位-100 mV，补偿串联电阻Rs(记录INa的Rs<2.5 MΩ，值稳定)和CSlow，以减少钳位误差和记录信号的失真。通过膜片钳放大器(HEKA,EPC-10,Germany)发放刺激冲动，激发的电流信号经AgClAg电极引导、放大器放大，由A/D转换器转换为数字信号，存于硬盘中以备分析。电流信号经截止频率2.9 kHz的四阶贝塞尔低通滤波，采样频率5 kHz。

　　1.4 数据处理 实验资料采用PULSE+PULSEFIT软件包测定，资料分析和图表处理采用Excel和Sigma Plot软件。试验数据以±s表示，采用方差分析进行统计。图1 DMSO对豚鼠心室肌细胞INa的影响

　　2 结果

　　2.1 豚鼠心室肌细胞INa随时间变化的特点 形成全细胞模式后，在电压钳模式下，保持电位-130 mV，给予幅值-35 mV，时程40 ms的去极化刺激引出一内向电流INa。连续观察50 min内豚鼠心室肌细胞INa的变化(图1)。可见从破膜后13 min至50 min电流处于稳定状态，给药及洗脱均在这段时间内完成。

　　2.2 DMSO对豚鼠心室肌细胞INa的影响 DMSO用钠外液稀释1 000倍后持续灌注细胞，实验方法同上，可以看出DMSO对INa没有任何影响(图1)。

　　2.3 RES浓度依赖性的抑制豚鼠心肌细胞INa 实验方法同上，观察RES(10，30，100 μmol/L)对心室肌细胞INa的作用。发现RES(30，100 μmol/L)浓度依赖性的降低INa峰值，抑制率分别为(17.3±3.1)%(P<0.005)，(52.7±10.2)%(P<0.01)(图2)。抑制作用快，发生在给药后的3 min左右，其中30 μmol/L抑制作用在给药后的7 min左右达到最大，而100 μmol/L抑制作用在给药后的10 min左右达到稳态。洗脱后均可以完全恢复。

　　2.4 TMS对豚鼠心肌细胞INa的影响 实验方法同上，观察TMS(1，3，10 μmol/L)对心室肌细胞INa的作用。发现10 μmol/L TMS降低INa峰值，作用快(3 min左右)，10 min时抑制率为36.8±5.6%(P<0.005)，洗脱后可完全恢复。1、3 μmol/L对INa没有明显的抑制作用(图3)。

　　2.5 RES对豚鼠心肌细胞INa电流-电压曲线(IV曲线)的影响 保持电位-130 mV，以5 mV的阶跃，给予(-80～+15) mV，时程40 ms，频率0.1 Hz的去极化脉冲，得到钠电流的IV曲线。本实验条件下，豚鼠心室肌细胞的最大激活电压在-30 mV左右，加入RES 100 μmol/L 8 min后，最大激活电压不变，但各电压条件下的INa峰值均降低,在-30 mV，INa从给药前的(-16.36±3.75)pA/pF降低到(-8.40±2.04)pA/pF(图4)。

　　2.6 TMS对豚鼠心肌细胞INa电流电压(IV)曲线的影响 保持电位-130 mV，以5 mV的阶跃，给予(-80～+15) mV，时程40 ms，频率0.1 Hz的去极化脉冲，得到INa的IV曲线。本实验条件下，豚鼠心室肌细胞的最大激活电压在-30 mV左右，加入TMS 10 μmol/L 8 min后，最大激活电压不变，但各电压条件下的INa峰值均降低,在-30 mV，INa从给药前的(-13.31±3.6)pA/pF降低到(-9.49±3.27)pA/pF(图5)。

　　3 讨论

　　在神经、心脏和骨骼肌等可兴奋组织，细胞膜上的钠通道在跨细胞膜动作电位的除极化过程中执行着传导钠离子电流的功能。钠离子通道活动异常将会导致一系列疾病的发生，如在心脏，钠离子通道活动紊乱，会影响心肌的电生理特性，出现心律失常等严重后果。很多药物都是通过影响钠离子通道而发挥治疗作用的，如I类抗心律失常药、局麻药及某些抗癫痫药等。

　　心肌细胞膜上存在着大量的钠钙交换体(INa/Ca)，它是一种双向转运蛋白，正常状态下，钠-钙交换电流以内向电流为主，使细胞内钙离子外排，这是维持胞内钙离子浓度的重要机制之一。INa/Ca对细胞内Na+浓度的变化十分敏感。心肌细胞内Na+浓度的升高促使INa/Ca反向转运，导致Ca2+内流，并由此诱发肌浆网释放Ca2+，最终使得胞内Ca2+增加[12]，致胞内钙稳态的破坏。

　　胞内钙稳态的破坏在再灌注损伤的发展中起重要作用[13]。缺血再灌注时使心肌细胞恢复正常的钙稳态，挛缩带坏死和梗死面积均可受到抑制。TMS是RES的甲基化衍生物，结构相似。RES在心血管方面的保护作用已深为人知，而对TMS的心血管保护作用却知之甚少。

　　本研究结果表明RES(10，30，100 μmol/L)浓度依赖性的抑制豚鼠心室肌细胞INa，对INa的抑制率分别为(6.7±2.7)%、(17.3±3.1)%和(52.7±10.2)%。本研究也发现TMS对豚鼠心室肌细胞INa具有类似于RES的快速抑制作用，洗脱后也可完全恢复，且药效显著强于RES，10 μmol/L TMS对INa抑制率为(36.8±5.6)%，1、3 μmol/L对INa抑制率分别为(5.5±0.9)%、(4.7±0.7)%。先前的研究已证实甲基化衍生物TMS某些方面作用强于RES，如抗血管增殖、抗炎、抗过敏、抗肿瘤等，我们的研究更进一步证实了此作用。可见，甲基化衍生物TMS比RES更具有潜在的心肌保护作用。

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