青蒿琥酯影响L929和Colon26肿瘤细胞免疫抑制的体外研究

　　【摘 要】 目的 研究青蒿琥酯对L929和Colon26肿瘤细胞培养上清免疫抑制作用的影响。 方法 制备体外经青蒿琥酯作用后，彻底洗去青蒿琥酯，再以新鲜培养液培养L929及Colon26，收取再培养上清，同时以不经青蒿琥酯作用的L929及Colon26同步处理的相应上清作对照。实验研究这些上清对小鼠脾细胞MTT法测定的NK杀伤和Con A诱导转化，以及流式细胞计数分析的CD4 + 及CD8+ 表达的影响。 结果 与对照组上清相比，青蒿琥酯作用L929和Colon26后，其第一次(A-L1、A-C1)及第二次48h再培养上清(A-L2、A-C2)对Con A诱导小鼠脾细胞转化的抑制率均明显降低(分别为37.50%±6.58%，P<0.01;27.83%±5.50%，P<0.05;48.71%±3.52%，P<0.01;5.48%±1.22%，P<0.01);CD4 + CD8- 细胞表达百分率均明显升高(分别为15.30%±3.51%，P<0.01;27.68%±2.78%，P<0.05;10.69%±3.42%，P<0.01;28.02%±1.08%，P<0.01);A-L1、A-L2及A-C1上清作用后，NK杀伤活性均明显升高(杀伤率分别为67.58%±4.83%，P<0.01;66.14%±4.10%，P<0.01;57.21%±3.38%，P<0.05)，A-C2对NK杀伤未产生明显改变(杀伤率为45.42%±8.98%，P>0.05)。 结论 青蒿琥酯可下调L929及Colon26肿瘤细胞培养上清的免疫抑制，下调肿瘤免疫抑制可能是青蒿琥酯的抗肿瘤新机制之一。

　　【关键词】 青蒿琥酯;L929;Colon26;免疫抑制

　　The Study of Effects of Artesunate on Immunosuppression from L929and Colon26Tumor Cells in Vitro CUI Cheng ，HU Jianjun，ZHANGYongjun，et al.

　　Bethune Military Medical College，Shijiazhuang 050081，China

　　【Abstract】 Objective To study the effects of artesunate on immunosuppression caused with L929and Colon26tumor cells in vitro.Meth-ods Re-cultured supernatants of L929and Colon26after treated by artesunate and followed by being washed respectively，and the corresponding supernatants of L929and Colon26treated without artesunate were collected as control.Through MTT，the effects of different supernatants on trans-formation induced by Con A and NK activity of murine splenocytes were studied.And through flow cytometry assay，the effects of different supernata-nts on murine splenocytes'expression of CD4+ and CD8+ were analyzed.Results Compared with control supernatants，the first(A-L1，A-C1)and second re-cultured supernatants of L929and Colon26(A-L2，A-C2)decreased the inhibitory rates of murine splenocytes'transformation in-duced by Con A significantly(37.50%±6.58%，P<0.01;27.83%±5.50%，P<0.05;48.71%±3.52%，P<0.01;5.48%±1.22%，P<0.01，respectively)，and increased the proportion of CD4+ CD8- cells greatly(15.30%±3.51%，P<0.01;27.68%±2.78%，P<0.05;10.69%±3.42%，P<0.01;28.02%±1.08%，P<0.01，respectively);A-L1，A-L2and A-C1but not A-C2up-regulated NK killing activity obviously(killing rate were67.58%±4.83%，P<0.01;66.14%±4.10%，P<0.01;57.21%±3.38%，P<0.05;45.42%±8.98%，P>0.05，respectively).Conclusion Artesunate can exert down-regulating effects on the immunosuppression from L929and Colon26tu-mor cells.Down-regulating the immunosuppression may be one of new anti-tumor mechanisms of artesunate.

　　【Key words】 Artesunate;L929;Colon26;Immunosuppression

　　肿瘤免疫抑制是肿瘤发生免疫逃逸的重要机制，在肿瘤的发生、发展中有着十分重要的作用，这可能是导致肿瘤生物治疗体内抗瘤效果欠佳的重要原因

　　[1-4] 。因此，研究下调肿瘤免疫抑制，是开发抗瘤药物、明确抗瘤药物抗瘤机制和指导临床合理应用抗瘤药物的重要方面。青蒿琥酯有一定抗瘤效应

　　[5-8] ，但有关其下调肿瘤免疫抑制的研究，作者未见国内外报道。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物及细胞株 健康封闭群昆明种小鼠，雌雄各半，质量18～22g，二级动物，河北省实验动物中心提供。小鼠结直肠癌细胞株Colon26，为河北医科大学第四医院科研中心单保恩教授惠赠;小鼠成纤维母细胞瘤细胞株L929和小鼠胸腺瘤细胞株YAC-1，均为河北医科大学基础所免疫室保存。

　　1.2 主要试剂及仪器 RPMI-1640为GIBCO公司产品，每升RPMI-1640完全培养液(CM)中含小牛血清0.1L、青霉素10万U和链霉素100mg。青蒿琥酯为桂林南药股份有限公司产品，60mg.瓶，用5%NaHCO3 溶解。藻红蛋白(PE)标记的大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体(PE-CD4)和异硫氰酸荧光素(FITC)标记的大鼠抗小鼠CD8单克隆抗体(FITC-CD8)为美国CALTAG公司产品。Mk353型酶联免疫检测仪为芬兰ThermoLabsystems产品;Vantage流式细胞仪为美国BD公司产品。

　　1.3 不经和经青蒿琥酯作用后传代的L929和Colon26培养上清的制备 收集对数生长期肿瘤细胞，分别用不含和含0.2mg.L青蒿琥酯的CM重悬L929细胞、不含和含6.25mg.L青蒿琥酯的CM重悬Colon26细胞至2×105 .ml(预实验已证明此终浓度的青蒿琥酯分别对L929和Colon26细胞无直接毒性)，37℃、5%CO 2 孵育箱中培养(L929培养24h，Colon26培养48h);培养结束后，离心弃上清。洗涤细胞2次，再加入新鲜CM重悬细胞至2×105 .ml，培养至上述相同时间，离心收集的上清即为第一次再培养上清(青蒿琥酯作用L929、Co-lon26后的上清分别称为A-L1、A-C1，无青蒿琥酯作用的L929、Colon26对照组上清分别称为control-L1、control-C1);沉淀细胞洗涤后，再加入新鲜CM将细胞重悬至2×105 .ml，培养至上述相同时间，收集的上清即为第二次再培养上清(青蒿琥酯作用L929、Colon26后的上清分别称为A-L2、A-C2，无青蒿琥酯作用的L929、Colon26对照组上清分别称为con-trol-L2、control-C2)。

　　1.4 青蒿琥酯对小鼠脾细胞免疫功能抑制的影响

　　1.4.1 对Con A诱导的小鼠脾细胞转化的影响 取1×10

　　7 .ml小鼠脾细胞悬液，加入96孔培养板，50μl.孔，再加入20mg.L Con A，50μl.孔，最后分别加入不同的肿瘤细胞培养上清，100μl.孔;并设立无肿瘤细胞培养上清的正常转化对照孔。均设3复孔，混匀后培养72h，MTT法检测，并按下列公式计算:抑制率=[(正常转化对照组A值-实验组A值).正常转化对照组A值]×100%。

　　1.4.2 对小鼠脾细胞CD4+ 和CD8+ 表达的影响 于培养瓶中分别加入小鼠脾细胞、Con A、不同的肿瘤细胞培养上清，使总反应体积均为2ml.瓶，并设立正常转化对照，混匀后培养72h。收集细胞后，PBS清洗2次，计数，各取细胞1×106 个，加入PE-CD4和FITC-CD8单克隆抗体各10μl，充分混匀，室温避光保存15min后，进行流式细胞计数分析。每次检测均设立淋巴细胞门，并用相同荧光素标记的大鼠无关同型IgG1作阴性对照。

　　1.4.3 对小鼠脾细胞NK杀伤活性的影响 以小鼠脾细胞作为效应细胞(Effector，E)，对数生长期YAC-1作为靶细胞(Target cell，T)。小鼠脾细胞浓度为2×107 .ml，50μl.孔;YAC-1细胞按40∶1的效靶比(E∶T)，50μl.孔;再分别加入不同的肿瘤细胞培养上清，100μl.孔，为E+T孔;并设立无肿瘤细胞培养上清的正常杀伤对照孔、单独E对照孔、单独T对照孔和培养液空白对照孔。均设3复孔，混匀后培养8h，MTT法检测。按下述公式计算:杀伤率=[1-(A E+T -AE ).A T ]×100%。

　　1.5 统计学处理 所有数据均以ˉx±s表示，用SPSS11.5版本软件包对数据进行方差齐性检验、t或t'检验。

　　2 结果

　　2.1 青蒿琥酯对小鼠脾细胞转化抑制的影响 与正常转化对照组相比，control-L1、control-L2、control-C1、control-C2上清

　　可明显抑制小鼠脾细胞转化(抑制率分别为48.71%±2. 88%、53.83%±3.42%、46.63%±7.68%、37.82%±6.71%，P<0.01);与之相比，A-L1、A-L2、A-C1、A-C2上清的抑制率均明显降低(分别为37.50%±6.58%，P<0.01;48.71%±3.52%，P<0.01;27.83%±5.50%，P<0.05;25.48%±5.22%，P<0.01)。

　　2.2 青蒿琥酯对小鼠脾细胞CD4 + 和CD8+ 表达抑制的影响 与正常转化对照组CD4+ 、CD8- 细胞的百分率(33.20%±2.92%)相比，control-L1、control-L2、control-C1、control-C2组的百分率均明显降低(分别为8.19%±0.46%、8.22%±0.74%、19.97%±0.98%、20.34%±1.99%，均P<0.01);与之相比，A-L1、A-L2、A-C1、A-C2组CD4+ CD8- 细胞的百分率均明显升高(分别为15.30%±3.51%，P<0.01;10.69%±3.42%，P<0.01;27.68%±2.78%，P<0.05;28.02%±1.08%，P<0.01)。上述各组之间的CD4+ CD8+ 、CD4- CD8- 及CD4- CD8+ 细胞百分率未见显著差异(P>0.05)。

　　2.3 青蒿琥酯对小鼠脾细胞NK杀伤活性抑制的影响 与正常杀伤对照组(杀伤率为65.39%±0.87%)相比，control-L1、control-L2、control-C1、control-C2上清可明显抑制小鼠脾细胞NK杀伤活性(杀伤率分别为60.97%±3.86%、59.59%±3.13%、49.62%±6.77%、52.31%±6.56%，P<0.01);与之相比，A-L1、A-L2、A-C1组的杀伤率均明显升高(分别为67.58%±4.83%，P<0.01;66.14%±4.10%，P<0.01;57.21%±3.38%，P<0.05);而A-C2上清对NK杀伤率未产生明显改变(45.42%±8.98%，P>0.05)。

　　3 讨论

　　在机体抗肿瘤免疫中，NK细胞介导的非特异性抗瘤和T细胞介导的特异性抗瘤作用十分关键。因此，本研究分析了青蒿琥酯对L929和Colon26细胞培养上清所致T、NK细胞功能抑制的影响。实验结果显示，青蒿琥酯作用于L929和Colon26后，可部分下调其培养上清对小鼠脾细胞转化的抑制。对L929的这种下调作用在洗去青蒿琥酯后至少可持续48h;对Colon26的这种下调作用在洗去青蒿琥酯后至少可持续96h。提示青蒿琥酯对不同肿瘤细胞免疫抑制的下调效果不同，可能与肿瘤细胞各自的免疫抑制特点有关，对不同肿瘤细胞的影响可能有各自不同的作用位点，或从不同途径发挥下调作用。

　　Con A是可刺激T细胞转化的有丝分裂原，而T细胞主要由CD4 + CD8- 及CD4- CD8+ 细胞组成。因此，我们又采用流式细胞计数方法，进一步分析了青蒿琥酯下调肿瘤细胞培养上清对小鼠脾细胞转化抑制的细胞靶向。实验结果显示，青蒿琥酯作用于L929和Colon26后，均可显著下调这两种肿瘤细胞培养上清对Con A诱导的小鼠脾细胞中CD4+ CD8- 细胞的表达抑制，但未能完全恢复至对照组水平。这表明，两种肿瘤细胞培养上清对T细胞免疫抑制作用的发挥，可能主要是通过抑制CD4 + CD8- T细胞的转化，进而降低机体针对肿瘤细胞的细胞免疫应答的功能，使肿瘤细胞可能以此逃避抗肿瘤免疫监视而进行性生长;而青蒿琥酯下调T细胞免疫抑制，可能也主要是通过提高CD4+ CD8- T细胞的数量和转化功能而实现的。

　　NK细胞是一类在早期非特异抗肿瘤免疫机制中起重要作用的效应细胞，处于机体抗肿瘤的第一道防线。本研究结果显示，青蒿琥酯作用L929细胞后，可下调其培养上清对小鼠脾细胞NK杀伤活性的抑制，并可使之完全恢复到对照水平，且这种逆转作用在洗去青蒿琥酯后至少还可以持续48h。对Colon26细胞，青蒿琥酯可部分下调其上清对小鼠脾细胞NK杀伤活性的抑制，且这种下调作用在洗去中药后至少可以持续48h。提示青蒿琥酯可能通过下调肿瘤细胞对NK杀伤活性的抑制，从而使NK细胞完全或部分恢复正常的抗瘤活性;但对不同肿瘤细胞抑制NK杀伤作用的下调程度和维持时间各不相同。

　　临床应用中药治疗或辅助治疗肿瘤，与其他抗肿瘤疗法相比，其独具的多途径、多靶点、低毒、有效、不对机体和机体免疫系统造成损伤的优势，在肿瘤治疗的发展中已显示出良好的应用前景。现已发现及应用于临床的抗肿瘤中药很多，其抗肿瘤活性已经在多方面得到证实;但以往国内外研究主要集中在中药上调机体免疫功能指标、诱导肿瘤细胞凋亡和分化、影响肿瘤组织血管生成以及对肿瘤细胞的直接生长抑制和细胞毒作用等方面，而对中药对肿瘤免疫抑制功能的影响报道甚少。本研究结果表明，中药提取物青蒿琥酯对L929和Colon26肿瘤细胞的免疫抑制，在不同方面亦有不同程度的下调。因此，下调肿瘤免疫抑制应是青蒿琥酯的抗肿瘤作用新机制之一;通过检测药物对肿瘤细胞免疫抑制的影响进行抗肿瘤药物的筛选，是一种切实可行的新途径，同时也可为临床合理选用抗瘤药物提供实验依据。

　　肿瘤细胞培养上清具有免疫抑制作用，肯定是肿瘤细胞向上清中分泌了有免疫抑制作用的物质1-4] ;青蒿琥酯作用

　　肿瘤细胞后，其培养上清的免疫抑制作用明显下降，很可能 是青蒿琥酯阻碍了肿瘤细胞合成及分泌这些免疫抑制物质。究竟青蒿琥酯可阻碍哪种或哪些免疫抑制物质的合成与分泌，则有待于进一步研究予以揭示，相关工作正在进行中。

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