伊马替尼对正常T淋巴细胞增殖和活性影响的体外研究

　　【摘 要】 目的 探讨伊马替尼在体外对正常T淋巴细胞增殖和活性的影响。 方法 应用免疫磁珠分选人外周血CD3 + 的T细胞，加入植物血凝素和抗人CD3单克隆抗体体外培养。运用MTT法检测不同浓度的伊马替尼对T细胞增殖的影响;采用ELISA法检测其分泌的细胞因子浓度;同时分别通过流式细胞仪和混合淋巴细胞培养检测T细胞表面免疫活性标志和杀伤活性。 结果 加伊马替尼组的T细胞增殖活性受到抑制，细胞因子IFN-γ分泌减少，表面活性分子CD25和CD69明显减少，其对白血病细胞杀伤活性均不同程度降低，并且该抑制作用有量效依赖关系。 结论 有效治疗浓度的伊马替尼在体外对T细胞增殖和活性有抑制作用。

　　【关键词】 伊马替尼;T淋巴细胞;细胞培养;植物血凝素

　　Imatinib Inhibits the Activation and Proliferation of Normal T Lymphocytes in Vitro ZHANGLin

　　，ZHOU Jian，HU Jieying.

　　Department of Clinical Laboratory，the5th Affiliated Hospital，Zhengzhou 450052，China

　　【Abstract】 Objective To study the effects of imatinib mesylate on the activation and proliferation of normal T lymphocytes in vitro.Meth-ods CD3+ T lymphocytes were purified by magnetic beads from freshly prepared PBMC and cultured in the presence of phytohemagglutinin.Prolif-eration of T lymphocytes was assayed by method ofMTT.Cytokine productionwas measured with a commercially available enzyme-linked immunosor-bent assay(ELISA)kit.Effects of imatinib on the function ofT lymphocytes were analyzed by a flow cytometry and mixed lymphocyte reaction.Re-sults T lymphocytes obtained from culture in the presence of imatinib showed concentration dependent reduced expression levels of activation mark-ers CD25，CD69.Dose-dependent inhibition of the proliferative response of purified CD3+ T lymphocytes to anti-CD3was similarly observed and associated with reduction in IFN-γproduction.Furthermore，imatinib inhibited the induction of primary cytotoxic T-lymphocyte responses to leuke- mia cell.Conclusion Therapeutic concentrations of imatinib inhibits the activation and proliferation of normal T lymphocytes in vitro.

　　【Key words】 Imatinib mesylate;T lymphocytes;Cell culture;Phytohemagglutinin

　　伊马替尼通过选择性竞争结合ABL酪氨酸激酶的ATP结合位点而有效地治疗慢性粒细胞白血病(CML)。而激活的ABL酪氨酸激酶同时也是免疫细胞分化和激活所必需的信号，伊马替尼可能通过阻断该信号途径抑制免疫功能。我们就伊马替尼对正常T淋巴细胞增殖和活性的影响进行了体外研究。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 12例健康人外周血细胞、RPMI-1640培养液、磷酸盐缓冲液(PBS)、10%胎牛血清(FCS)、植物血凝素(PHA)，二甲基亚砜(DMSO)、伊马替尼、抗人CD3单克隆抗体，L-谷氨酰胺，FITC标记的CD69和CD25，PE标记的HLA-DR单克隆抗体，四甲基偶氮唑盐(MTT)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 分离、培养T细胞 取健康人外周血40ml，分离外周血单个核细胞，用免疫磁珠分选出CD3 + 的T淋巴细胞。洗涤后，用RPMI-1640完全培养液悬浮，并调整浓度为2×106 . ml，分为对照组、A组、B组和C组，同时加入PHA(5μg.ml)。37℃、5%CO2 、饱和湿度条件下培养。24h后A组、B组和C组分别加入用DMSO溶解的浓度为1、2、5μmol.L(和体内有效治疗浓度相当)的伊马替尼，对照组中加入等量的DMSO。培养48h后加入抗CD3单克隆抗体(50ng.ml)，72h后分别检测T细胞增殖和活性。每2d半量换液，并补充等量PHA、抗CD3单克隆抗体和伊马替尼。

　　1.2.2 检测T细胞增殖活性 分别于抗CD3单克隆抗体加入前和加入后48h、72h加MTT20μl(5mg.ml)，酶标仪450nm处测各孔OD值。

　　1.2.3 检测T细胞分泌的细胞因子 取上清检测IFN-γ和IL-4的浓度，检测方法参照相应的检测试剂盒，检测范围均为16～1000pg.ml，所有标准孔及样品均做复孔。

　　1.2.4 检测T细胞表面活性标记 用标记液PBA(PBS+10%BSA+0.02%叠氮钠)悬浮细胞，加入CD25、CD69、HLA-DR单克隆抗体标记，通过流式细胞仪检测细胞表型。

　　1.2.5 检测活化的T细胞对白血病细胞的杀伤活性 以正常培养的活化T细胞为对照，选生长良好的HL60细胞为靶细胞，将T细胞与靶细胞以1∶10、1∶20和1∶50效靶比加入96孔圆底板中培养6h，收集上清，采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法进行T细胞杀伤活性测定。细胞毒性(%)=(效应细胞组-靶细胞自然释放组-效应细胞自然释放组).(最大释放组-靶细胞自然释放组)×100%。

　　1.2.6 统计处理 所有实验数据用ˉx±s表示，用SPSS10.0统计软件对结果进行t检验。

　　2 结果

　　2.1 T细胞增殖活性 见表1。和对照组相比，A、B组OD值有所减低，但差异无显著性(P>0.05)，而C组OD值明显降低，P<0.05。表1 伊马替尼对T淋巴细胞增殖活性的影响(OD值)

　　2.2 T细胞分泌的细胞因子 CD3单克隆抗体刺激72h后对照组和A、B、C组IFN-γ的浓度分别为(7647±883)、(4036±625)、(3865±567)、(3287±536)pg.ml;IL-4浓度分别为(6848±982)、(6374±874)、(6281±796)、(5983±851)pg.ml。4组IL-4分泌量的差异无显著性(P>0.05)，A、B、C组IFN-γ分泌量较对照组明显减少(P<0.05)。

　　2.3 活化T细胞的表面免疫标记 见表2。 表2 伊马替尼对T淋巴细胞表面免疫活性标记表达的影响 注:与对照组比较， * P<0.05， ** P<0.01

　　2.4 激活T细胞对白血病细胞杀伤作用 见表3。不管活化T细胞和HL60靶细胞按照何种比例混合培养，与对照组相比，A、B、C组的T细胞对HL60细胞的杀伤活性均逐渐减弱。 表3 伊马替尼对激活T细胞杀伤白血病细胞的影响注:与对照组比较， * P<0.05， ** P<0.01

　　3 讨论

　　伊马替尼是一种人工合成的强有力的酪氨酸激酶抑制剂，通过特异性地竞争抑制BCR.ABL酪氨酸激酶的活性，阻断多条信号传导途径，达到治疗CML的目的[1] 。但治疗过程 中出现的血细胞减少症是否与其抑制正常造血祖细胞增殖和分化有关还不清楚。尽管伊马替尼治疗CML患者的随访时间还不够长，但已有感染和恶性肿瘤发生率增高的报道2，3] ，说明伊马替尼对免疫功能有明显的影响。

　　本研究观察不同浓度的伊马替尼对T细胞增殖的影响，结果显示:不管单用PHA还是PHA联合抗CD3单克隆抗体刺激T细胞增殖，其OD值有所减低，A、B组和对照组相比，无统计学差异，而C组则明显降低(P<0.05)。说明伊马替尼能够抑制T细胞的增殖，并有浓度依赖关系，这和Cwynarski[4] 与Seggewiss等5] 的研究结果基本一致。

　　本研究T细胞分泌细胞因子功能的检测显示:CD3单克隆抗体刺激后，4组T细胞IL-4分泌量之间的差异无显著性，IFN-γ分泌量之间有明显差异。表明伊马替尼能抑制T细胞活化为效应T细胞，但对免疫调节作用无影响。活化T细胞的免疫标记检测显示，实验组CD25、CD69及HLA-DR的表达有所减低，但仅C组比对照组明显降低，从另一侧面表明伊马替尼抑制T细胞激活。活化T细胞对白血病细胞杀伤活性的检测表明，不管活化T细胞和HL60靶细胞以何种比例混合培养，T细胞对HL60细胞的杀伤活性随着伊马替尼浓度增高而逐渐减弱。说明伊马替尼有明显抑制T细胞的杀伤作用，并且有量效依赖关系。

　　本研究表明有效治疗浓度的伊马替尼能够抑制T细胞的增殖和活化。该发现有重要的临床价值，因为长期应用伊马替尼才能防止CML患者病情复发，而药物副作用相关的免疫损害将改变机体的免疫监视作用，所以疾病的长期控制将导致免疫功能损害。因此笔者认为伊马替尼联合干扰素治疗CML，一方面可防止CML患者对伊马替尼耐药，另一方面可能是抵消伊马替尼对机体的免疫抑制作用。至于在体内伊马替尼是否同样抑制免疫功能还有待深入研究。

　　参考文献

　　1 O'Dwyer ME，Mauro MJ，Druker BJ.Recent advancements in the treat-ment of chronic myelogenous leukemia.Annu Rev Med，2002，53:369-381.

　　2 Baskaynak G，Kreuzer KA，Schwarz M，et al.Squamous cutaneous epi-thelial cell carcinoma in two CMLpatients with progressive disease under imatinib treatment.Eur J Hematol，2003，70(4):231-234.

　　3 Mattiuzzi GN，Cortes JE，Talpaz M，et al.Development of Varicella-Zos-ter virus infection in patients with chronic myelogenous leukemia treatedwith imatinib mesylate.Clin Cancer Res，2003，9(3):976-980.

　　4 Cwynarski K，Laylor R，Macchiarulo E，et al.Imatinib inhibits the activa-ti on and proliferation of normal T lymphocytes in vitro.Leukemia，2004，18(8):1332-1339.

　　5 Seggewiss R，Lore K，Greiner E，et al.Imatinib inhibits T-cell receptor-mediated T-cell proliferation and activation in a dose-dependent manner.Blood，2005，105(6):2473-2479.