小鼠LAK细胞MHC表达水平对其体外杀伤肿瘤活性的影响

　　【摘要】 目的 探讨LAK细胞表面MHC的表达水平与体外肿瘤细胞杀伤活性的关系。方法 使用siRNA沉默小鼠LAK细胞MHCⅠ(H2Kd)分子的表达，同时设空转染组和无关序列组，流式细胞仪检测不同组别靶蛋白的表达，LDH释放试验检测H2Kd表达降低的LAK细胞对K562和H22肿瘤细胞株的杀伤活性。结果 流式细胞检测证实siRNA能够抑制靶蛋白的表达，H2Kd表达降低组对K562和H22肿瘤细胞的杀伤活性与对照组相比明显降低，空转染组和无关序列组与对照组无显著性差异。结论 小鼠脾LAK细胞表面H2Kd的表达水平与其体外杀伤活性相关。

　　【关键词】 H2 小的干涉双链RNA 淋巴因子激活的杀伤细胞 细胞株

　　LAK cells by small interfering RNA duplexes in mice

　　SHAN Ningning1,　ZOU Xiong1,　ZHANG Yi1,　YANG Xiaojing1,

　　ZHUANG Xuewei1, WANG Hongchun1,　HOU Ming2

　　(1. Clinical Laboratory; 2. Tumor Research Center, Qilu Hospital of Shandong University, Jinan 250012, China)

　　Abstract: Objective To investigate the relationship between major histocompatibility complex (MHC) expression of lymphokine activated killer (LAK) cells and the cytotoxicity in vitro. Methods H2Kdtargeting small interfering RNA (siRNA ) was applied to spleen lymphocytes of BABL/C mice. Flow cytometry (FCM) was used to determine the expression of H2Kd on the transfected and control cells. The cytotoxicity for H22 and K562 cell lines of the transfected cells was determined in vitro by the LDH release assay. Results siRNA treatment for H2Kd gene significantly decreased the expression level of the targeted protein, pure transmessenger and nonsilencing siRNA did not inhibit the H2Kd expression at the tested concentrations. The cytotoxicity for H22 and K562 cells was significantly decreased. Conclusion siRNA reduced downexpression of H2Kd may have some relation to LAK cells cytotoxicity for neoplasm cell lines.

　　Key words: H2; siRNA; Lymphokine activated killer cells; Cell lines 主要组织相容性复合体(MHC)的编码产物是抗原提呈和T细胞活化的关键分子，在免疫应答和免疫调节中发挥重要作用[12]。人类肺、结直肠、肝脏、乳腺等肿瘤患者中普遍存在淋巴细胞MHCⅠ表达下降[35]。本研究利用RNA干扰技术,通过小片断干扰RNA (siRNA)封闭BALB/c小鼠MHCⅠ类基因(H2Kd)，观察鼠LAK上MHCⅠ表达水平与杀伤肿瘤能力的关系，探索LAK细胞上MHCⅠ类分子在肿瘤免疫中的作用，同时为构建H2Kd降低的体内实验模型提供了实验基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要材料和试剂 RPMI1640培养基、胎牛血清，购自美国GIBCO公司;CytoTox 96(r) NonRadioactive Cytotoxicity Assay试剂盒购自美国Promega公司(G1780);小鼠淋巴细胞分离液购自上海化学试剂公司;FITC标记的抗H2Kd单克隆抗体及同型对照购自美国BD公司。

　　1.2 实验动物和细胞株 SPF级BABL/C小鼠，12只，由山东大学实验动物中心提供，小鼠体重18 22?g，雌性小鼠6只，雄性小鼠6只。人白血病细胞株K562由山东大学齐鲁医院肿瘤中心长期保存,H22小鼠肝癌细胞株由山东大学齐鲁医院曲迅教授馈赠。

　　1.3 小鼠脾LAK细胞的制备 常规无菌制备小鼠脾细胞悬液，小心加入淋巴细胞分离液中，2?000r/min离心20?min，吸取单个核细胞层，用不含胎牛血清的RPMI1640培养液洗涤3遍，收集单个核细胞后，用含10%胎牛血清的RPMI1640稀释至浓度为1×109/L，置于含白细胞介素2(interleukin2，IL2)1?000?U/mL，10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基中，37?℃，5%CO2中培养36?h。

　　1.4 siRNA的合成和转染 选择互补于BABL/C小鼠H2Kd基因起始密码下游264?bp处21?nt(碱基)作为靶序列，合成siRNA(序号：23802，23803),同时设阴性对照, TransMessengerTM Transfection reagent,由德国QIAGEN公司合成。

　　靶序列：AAGAGCGATGAGCAGTGGTTC

　　正义链：5′GAGCGAUGAGCAGUGGUUCdTdT3′

　　反义链：3′dTdTCUCGCUACUCGUCACCAAG5′

　　siRNA 90?℃加热1?min，37?℃孵育60?min后用于实验，脾LAK细胞培养36?h后调节细胞浓度,4×105个细胞/孔接种于24孔培养板中，随机分为6组,每组设5个复孔，加入siRNA/TransMessenger比例为1.6?μg/2?μL,1.6?μg/4?μL,1.6?μg/8?μL分别设为2、3、4组，单纯转染剂TransMessengerTM Transfection reagent设为5组，空白对照和无关序列siRNA设为1、6组，84?h后采用流式细胞仪检测蛋白抑制情况。

　　1.5 流式细胞术检测H2Kd的表达 各组细胞每孔取100?μL与FITC标记的抗H2Kd单克隆抗体及同型对照抗体孵育30?min,流式细胞术检测siRNA对靶蛋白的抑制情况。

　　1.6 siRNA或TransMessenger对LAK细胞的毒性测定 转染后各组分别吸取细胞悬液200?μL于96孔培养板中，每组设5个复孔。培养96?h后，加入MTT 10?μL/孔，继续孵育4?h，吸弃上清，加入二甲基桠枫(DMSO)100?μL/孔,同时设空白对照组。混匀后置492?nm检测波长，645?nm参考波长处测定各孔吸光度(A)，以A值的大小反应淋巴细胞活性。

　　1.7 LAK细胞杀伤活性的测定 各组效应细胞和靶细胞按不同的效靶比例混合加入96孔板，每个试验设8个复孔，重复三板。应用LDH释放试验测定不同H2Kd表达率的LAK细胞的肿瘤细胞杀伤活性，按CytoTox 96(r) NonRadioactive Cytotoxicity Assay试剂盒操作指南选择最佳靶细胞数0.5×105/mL。用完全培养基调整效应细胞-淋巴细胞的浓度，以各组效应细胞和靶细胞按不同的效靶比例混合加入96孔板，每个试验设8个复孔，重复3板。同时设效应细胞和靶细胞自发释放孔，靶细胞最大释放孔，培养液对照孔，将细胞培养板移入CO2恒温培养箱，在37?℃，5%CO2浓度和饱和湿度的条件下培养4?h后，离心250?r/min,4?min，取上清50?μL，用多孔加样枪转移至96孔培养板中，在每个孔中加入50?μL substact buffer，避光室温30?min后，每孔加入50?μL stop solution，在酶联免疫检测仪上，选择492?nm检测波长，645?nm参考波长，以培养液对照孔调零,测定各孔吸光度A，按下式计算LAK细胞活性。

　　LAK细胞活性(%)=(实验孔LDH活性-靶细胞自发释放孔LDH活性-效应细胞自发释放孔LDH活性)/(最大释放孔LDH活性-靶细胞自发释放孔LDH活性)×100%

　　1.8 不同MHC状态的LAK细胞对肿瘤细胞攻击的形态学观察 将培养第五天siRNA组和正常对照组的LAK细胞稀释成1×106/mL,H22肝癌细胞和K562白血病细胞均稀释为5×104/mL，各取5?mL，置培养瓶中混合培养12?h，常规固定，脱水，HE染色，高倍光镜下观察。

　　1.9 统计学处理 采用SPSS8.0软件包进行分析，数据先经正态分布检验和方差齐性检验，若符合正态分布和方差齐性的条件则进行单项方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 siRNA或TransMessenger对LAK细胞的毒性测定 在使用siRNA和转染剂期间，各组的淋巴细胞均未见细胞形态学异常及细胞破碎等毒性改变;空转染组仅加入较大剂量(8?μL)转染剂TransMessenger，nonsil组加入的为非特异性序列，两组对细胞均无明显毒副作用，见表1。

　　2.2 siRNA对MHCⅠ分子表达的影响 不同比例的siRNA/TransMessenger对靶蛋白均有明显的抑制作用(P<0.01)，其中4组H2Kd蛋白的表达降至(40.5±4.5)%，降低最明显，5组为空转染组，仅加入较大剂量(8?μL)转染剂TransMessenger，对靶蛋白无明显抑制作用(89.5±5.3)%(P>0.05)，6组为无义序列组，非特异性序列并未引起H2Kd蛋白表达(89.0±3.6)%的下降(P>0.05)。见表2，图1。

　　2.3 LAK细胞肿瘤杀伤活性的测定 siRNA抑制组的LAK细胞对自体实体瘤H22细胞株的杀伤活性(E:T=40/1)由(81.6±5.9)%降到(65.0±2.1)%，nonsiRNA组的LAK细胞的杀伤活性(82.0±2.6)%，空转染组为(80.56±4.6)%，(E:T=40/1)，与对照组无明显差异(P>0.05)。但在E:T=10/1时，对H22肿瘤细胞杀伤活性无显著性差异。siRNA抑制组的LAK细胞对异体敏感肿瘤株K562的杀伤活性(E:T=40/1)也由(76.8±5.8)%降到(49.6±7.7)%,nonsil组的LAK细胞的杀伤活性(80.0±9.7)%,与对照组无明显差异(P>0.05)，见表3，4。

　　2.4 LAK细胞对肿瘤细胞的攻击 高倍镜下观察LAK细胞与肿瘤细胞，二者在形态大小上相差明显，容易鉴别。效应/靶细胞(20/1)的对照组培养12?h后，死亡肿瘤细胞多见，LAK细胞呈卫星状环绕肿瘤细胞，有的LAK细胞以整体细胞的形式穿破瘤细胞。如图2箭头所示，LAK 细胞环绕瘤细胞，瘤细胞死亡多见。箭头上方的肿瘤细胞周围LAK细胞成卫星状包围，可见LAK细胞压迫瘤细胞。效应/靶细胞(20/1)的siRNA组如图3、图5，LAK细胞仅有少数与瘤细胞接触，少见卫星现象，死亡的肿瘤细胞较少见。见图2，图3，图4，图5。

　　3 讨 论

　　近十余年，国内外学者研究发现肿瘤细胞表面MHCI类分子表达减弱, T细胞受体难以有效识别肿瘤抗原，是免疫逃逸的重要原因。肿瘤细胞MHC表达越弱，肿瘤的恶性度越高，越易转移，生存期越短。我们的前期研究也证实了这一现象，肿瘤细胞表面MHC表达的下调是肿瘤免疫逃逸的基础，肿瘤细胞MHC表达程度代表了肿瘤细胞的特性。这一发现通过流式细胞术和基因分析法在临床病人得到了验证，Le morvan等[6]的研究也表明，外周血淋巴细胞表面MHC表达随年龄老化而降低，与机体免疫功能随年龄老化而衰退一致。但淋巴细胞表面MHC表达的强弱在肿瘤免疫中的作用尚不清楚。我们首次利用siRNA封闭BALB/c小鼠MHCI类分子基因(又称H2Kd)，观察MHCI基因封闭前后淋巴细胞杀伤肿瘤能力的变化。

　　RNAi(RNA interference)是一种内源性或外源双链RNA(doublesranded RNA,dsRNA)介导的引起细胞内序列特异性的基因关闭或基因缄默现象。在哺乳动物，长于30?nt的dsRNA会抑制未分化细胞特异基因表达，而在分化细胞通过激活抗病毒防御机制，诱导产生PKR、IFNs等，导致RNA转录产物非特异性降解和蛋白合成的完全停止。最近这个障碍通过体外合成21?nt的siRNAs得到突破。siRNAs足够长可以诱导基因特异性抑制反应，但又足够短避免宿主干扰素反应[7]。

　　H2Kd是BALB/c小鼠的MHCI类分子，编码H2Kd的基因位于第17号染色体上，为一个1?540个碱基组成的开放阅读框架。本研究对H2KdsiRNAs的设计主要依据Elbashir等[8]的报道。我们从美国国立图书馆的GENEBANK数据库检索小鼠H2Kd的 cDNA序列中(序列号为U47329)的1?540个碱基的靶mRNA，本文选择起始密码下游264?bp处AAGAGCGATGAGCAGTGGTTC(GC含量52.4%)。并使用NCBI服务器的BLAST将可能的靶位点和相应的基因组数据库(小鼠)进行对比，没有超过16 17个邻近碱基与该编码序列有同源性。

　　靶序列：AAGAGCGATGAGCAGTGGTTC

　　正义链：5′GAGCGAUGAGCAGUGGUUCdTdT3′

　　反义链：3′dTdTCUCGCUACUCGUCACCAAG5′

　　H2KdsiRNAs与小鼠脾LAK细胞混合培养后，H2Kd分子的表达率明显下降，同时，MTT法测定不同组别的细胞活性没有明显改变，倒置显微镜下观察，细胞形态亦没有明显的改变。siRNAs及转染剂对细胞无明显毒副作用，对H2Kd蛋白表达的抑制作用不是通过非特异性毒副作用实现的，从而证明siRNAs是抑制H2Kd蛋白表达的有效方法。LAK细胞杀伤活性在诱导后3 7?d最高，本研究采用IL2诱导后第36?h加入siRNA,继续培养84?h，即IL2诱导第5天测定LAK细胞的肿瘤细胞杀伤活性。H2Kd降低的LAK细胞肿瘤细胞杀伤活性明显降低，对异体敏感肿瘤株K562的杀伤活性和自体实体瘤H22细胞株的杀伤活性均明显降低，空转染组和无关序列组的LAK细胞的杀伤活性与对照组无明显差异(P>0.05)。表明H2KdsiRNA是通过抑制靶蛋白的表达影响LAK细胞杀伤活性，而不是因为siRNA和转染剂对LAK细胞的非特异性作用抑制其对肿瘤细胞株的杀伤作用的。

　　鼠脾淋巴细胞的H2Kd的表达在体外肿瘤细胞识别、杀伤活性中起重要作用，同时为构建H2Kd降低的体内实验提供一个离体的实验基础。但LAK细胞表面H2Kd蛋白表达的下降如何影响肿瘤细胞杀伤的具体确切机制不明，有待进一步研究。

　　【参考文献】

　　[1] 邹雄,张利宁.分子免疫学与临床[M].济南:山东科技出版社,2002：283300.

　　[2] Andratschke M, Pauli C, Stein M, et al. MHCclass I antigen expression on micrometastases in bone marrow of patients with head and neck squamous cell cancer[J]. Anticancer Res, 2003， 23(2B):14671471.

　　[3] 杨晓静,邹雄,王传新,等.外周血单个核细胞中乙型肝炎病毒感染与细胞表面HLAI类抗原表达的关系探讨[J].中华医学杂志,2002,82(21):14991450.

　　[4] 张义,邹雄,单宁宁,等.外周血淋巴细胞HLAB基因mRNA的检测[J].中华检验医学杂志, 2004, 26(3)：164166.

　　[5] Wang C X, Zou X, Wang L F, et al. Expression of MHC antigen in tissues and peripheral blood lymphocytes of patient with gastric carcinoma[J]. Tumor Marker Oncol, 2003, 18(1):3746.

　　[6] Le Morvan C, Cogne M, Troutaud D, et al. HLAA and HLAB transcripition decrease with aging in peripheral blood lymphocytes[J]. Clin Exp Immunol, 2001, 125(2):245250.

　　[7] Sayda M, Elbashir, Winfried L, et al. Duplexes of 21nucleotides RNAs mediated RNA interference in cultured mammalian cells[J]. Nature, 2001, 411:494.

　　[8] Elbashir S M, Lendeckel W, Tuschl T. RNA interference is mediated by 21and22nucleotides RNAs[J]. Genes Dev, 2001, 15(2):188200.