长期酒精灌胃对大鼠肝脏糖原含量和肝组织的影响

　　【摘要】 目的 观察长期酒精灌胃对Wistar大鼠肝组织糖原含量及结构的影响。方法 48只大鼠随机分4组，按酒精灌胃剂量分为A组：0.5?g/(kg·d)、B组：2.5?g/(kg·d)、C组：5?g/(kg·d)及对照D组(生理盐水等容量灌胃)进行观察比较。5个月后取肝组织，行一般性体质参数、肝组织HE染色、PAS染色及肝糖原含量(M2酶标仪，比色法)等测定。结果 与对照组比较,酒精灌胃鼠的体重、肝重均有降低，B、C组降低明显; 肝组织糖原定量分析显示，A、B、C 3组糖原含量均明显降低，酒精灌胃剂量与肝组织糖原含量呈明显相关性(P<0.001)，大剂量C、B组糖原降低显著;HE染色显示，酒精灌胃大鼠的肝细胞脂滴空泡增大、增多，炎性细胞浸润;PAS染色显示糖原颗粒明显减少，B、C组明显。结论 长期酒精灌胃明显降低Wistar 大鼠肝细胞内糖原储备水平，造成的肝细胞脂肪变及炎性病变对肝组织结构有明显的损伤作用。

　　【关键词】 酒精 肝组织 糖原 Wistar大鼠

　　structures of the livers of Wistar rats

　　CHEN Shaohua1，3, ZHAO Jiajun1, FENG Li1, HOU Xiaolei2, ZHANG Wei3, YU Hui3, GAO Ling2

　　(1. Department of Endocrinology, Shandong Provincial Hospital, Jinan 250021, China;

　　2. Institute of Pharmacology, Shandong Provincial Hospital, Jinan 250021, China;

　　3.Department of Endocrinology, Qianfoshan Hospital of Shandong Province, Jinan 250014, China)

　　Abstract: Objective To investigate the effects of a longterm ethanol feeding on the glycogen content and structure of the liver in rats. Methods 48 rats were randomly divided into 4 groups: the ethanol groups A, B and C and the control group. Rats were subjected to ethanol of 0.5, 2.5, and 5?g/(kg·d) in the experimental groups respectively and saline in the control group for 5 months. Different physical parameters, HE staining, PAS staining and the glycogen content( Colorimetry, SpectraMax M2，) were determined. Results Compared with group D, groups A, B and C showed a lower weight of body and liver. Glycogen levels of groups A, B and C decreased, and the glycogen decreased in an ethanol dosedependent manner. HE staining showed lots of lipid vacuoles and inflammatory cells in groups A, B and C relative to group D. On the other hand, PAS staining revealed a decrease of glycogen granules. Conclusion Longterm intake of ethanol influences the glycogen content and causes some damage to the structure of liver tissues.

　　Key words: Ethanol; Liver; Glycogen; Wistar rats

　　长期饮酒对肝脏的损伤影响已被公认，如酒精及其代谢产物可引起肝脏的脂肪变、炎症及酒精性肝硬化等病变，酒精有可能通过其氧化代谢干扰肝脏对物质的代谢作用，如糖代谢异常,糖异生障碍。但酒精对于肝脏内糖代谢及糖原代谢的影响及作用一直没有定论。流行病学资料提示，长期少量规律饮酒可增加胰岛素敏感性，降低2型糖尿病的发病率;而长期和大量饮酒则可诱导胰岛素抵抗，损害机体糖耐量[12]。国内外关于酒精对糖、脂代谢的研究多集中在糖转运信号通路方面，而对能量储存中的重要环节，糖原代谢影响研究较少。本研究对长期酒精灌胃的大鼠肝组织和糖原水平进行了初步研究，报道如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物实验 雄性Wistar大鼠48只，购于山东省卫生防疫站，体重(150±5)g。适应性喂养1周后，按体重随机分为4组：A组：酒精量0.5?g/(kg·d)、B组：酒精量2.5?g/(kg·d)、C组：酒精量5?g/(kg·d);对照组 D组：蒸馏水5?g/(kg·d)。酒精和蒸馏水均由胃管灌注，食用酒精来自济南趵突泉酒厂，1次/d。连续喂养5个月。实验期间，随意进食、饮水，垫料消毒，每日更换。监测指标：每日观察毛色、外观、精神状态等。分别于0、14、20周末尾静脉取血。测空腹血糖(FPG) 、空腹胰岛素(FINS)水平,计算FPG与FINS乘积(FPG×FINS)，并推算胰岛素抵抗指数(HOMAIR)。期间A组死亡2只,B、C组分别死亡1只，对照组无死亡。

　　1.2 标本制作 鼠处死前夜禁食、禁水，第2天称重，用10%水合氯醛0.3 0.4?mL/100?g麻醉，迅速在冰上分离肝脏，用生理盐水洗净血液，滤纸吸干并称重和计算腹腔内脂肪情况。肝脏组织一部分置于4%多聚甲醛中固定，病理切片时用;另一部分迅速置于液氮保存。

　　1.3 HE 染色观察肝脏组织和细胞结构 肝组织石蜡切片在二甲苯中脱蜡10?min，移入二甲苯和纯酒精(1∶1)混合液中5?min左右，入100、95、85、70%酒精，各为5?min，最后经蒸馏水转入苏木精染液。染色8?min，水洗玻片上多余染液，1%盐酸酒精(70%酒精配制)分色片刻，镜检控制，至细胞核及核内染色质清晰，约数10?s，然后流水冲洗10?min，在碳酸锂饱和液中短时间碱化，细胞核呈蓝色，蒸馏水短洗。随后0.5%伊红染液染色3 5?min，依次经70、85、95、100%酒精脱水，各为3?min，二甲苯透明(2次)，共约10?min。最后封片：擦去切片周围二甲苯，滴加适量中性树胶，再加盖玻片封固。

　　1.4 PAS染色观察肝细胞糖原颗粒 肝组织石蜡切片(5?μm)在Carnoy氏液4?℃固定3?h，酒精脱水、二甲苯透明，石蜡包埋，切片，采用70%酒精展片。脱蜡：先后二甲苯两次5?min，然后100%酒精置5?min，70%酒精放置1?min。将其浸入过碘酸酒精液反应10?min，经70%酒精洗片刻，浸入Schiff氏酒精液反应15?min，亚硫酸水洗3次，洗去多余的非特异性结合的色素及扩散的染料，流水冲洗5?min，蒸馏水洗，浸入Ehrlich苏木精复染30 60?s使细胞核着色。脱水：95%酒精两次3?min处理，100%酒精2次3?min，二甲苯透明10?min 2次。最后加盖片镜检或树胶封固后镜检。

　　1.5 糖原含量检测

　　1.5.1 组织处理 冷冻肝组织0.1?g沾去水分称重，PBS洗2次。制匀浆,超声粉碎，并使之体积为?0.5mL。

　　1.5.2 组织糖原测定 取葡萄糖按400、200、100、50、25、12.5、6.25及3.12?μg/mL配制液体,备做标准曲线糖浓度。比色测定[34]：将0.1?g冰冻肝组织匀浆加入0.5?mL 30% KOH 溶解，100?℃ 放置10?min，后置于室温下3?min。用30% KOH将上述匀浆稀释10倍并摇匀，加入1.5?mL无水酒精，4?000?r/min离心20?min。弃去上清液，将沉淀中加入蒸馏水使之体积为0.5?mL。随后添加1?mL 0.2% 蒽酮 (0.2?g蒽酮与100?mL 98% H2SO4混合配制并混匀)，样本置室温30?min。在620?nm波长上机(美国SpectraMax M2酶标仪)检测其光密度值。

　　1.6 统计学处理 采用 SPSS 11.5医学统计学软件，实验数据用±s表示;多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验，两变量间采用相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 FPG、FINS、FPG×FINS变化 5个月酒精灌胃后，与正常对照组比较，酒精各组FPG、FINS、FPG×FINS水平无明显改变，多组间方差分析检验显示，A、B、C 3组与D组比较差异无统计学意义，见表1。

　　2.2 体重、肝脏重量、肝重/体重比值和HOMA指数改变 大鼠的体重和肝脏重量有相应的变化， C、B、A、D组体重、肝脏重量均呈递次增高，酒精灌胃量大C组下降最为明显;但肝重/体重比值改变不明显。行多组间方差分析检验显示体重存在差异(P<0.001)，Q检验显示C组与D组、B组与D组、C组与A组均存在显著差异;经多组方差分析显示，肝脏重量也有差异(P<0.001)，q检验C组与D组、B组与D组存在显著差异。Spearman直线相关分析显示，酒精灌胃量与体重(Coefficient=-0.611,P<0.001)、肝脏重量(Coefficient=-0.490,P<0.001)均呈明显负相关，与肝重/体重比值关系则无统计学意义。酒精灌胃A、C组HOMAIR有轻度增加，但差异无统计学意义，见表1 2。

　　2.3 肝脏糖原水平 A、B、C 3组糖原含量呈递次降低的趋势，并低于D组(见表2);多组方差分析显示差异有统计学意义(P< 0.001)，q检验中C组与D、B及D组以及C组与A组存在明显差异(P<0.05)。Spearman直线相关分析显示，糖原含量与酒精灌胃量呈明显负相关(Coefficient=-0.554,P<0.001);糖原含量还与体重(Coefficient0.422,P<0.01)均呈正相关，而与肝脏重量、肝重/体重比值、FPG、FINS、FPG×FINS和HOMAIR均未见相关。

　　2.4 各组肝组织HE染色结果 C组：肝组织结构相对松散，细胞间质成分减少，有时排列呈条索状，脂肪变性改变，可见较多大小空泡(脂粒)，伴有汇管区炎性细胞浸润。B组：结构尚紧密，肝细胞间隙较大，细胞胞浆内散在空泡(脂粒)，较C组数量减少，伴有汇管区炎性细胞。A组：尚完整致密，也有排列紊乱，肝细胞间质成分少，存少量细胞内空泡(脂滴)，轻度血管旁区炎性细胞聚集。D组：组织结构、细胞排列较对照组有序致密，细胞内空泡(脂滴)少见，也未见炎性细胞聚集，见图1。图1 酒精灌胃后HE染色肝组织病理改变(×20)

　　2.5 各组肝组织PAS染色结果 C组：细胞形态变形排列紊乱，见空泡(脂粒)，细胞间、细胞内PAS染色相对单薄，呈不均匀样。B组：细胞形态尚完整，间质成分少，裂隙大，排列欠规则，以汇管区为著，细胞间、细胞内PAS染色相对均匀性差。A组：细胞形态排列尚好，间质裂隙小，见少量空泡，细胞间、细胞内PAS染色相对单薄，呈不均匀样。D组：细胞结构致密完整，排列较整齐，无裂隙，细胞间、细胞内PAS染色与A、B、C 3组比较明显饱满、均匀，见图2。图2 酒精灌胃后PAS染色肝组织病理改变(×20)

　　3 讨 论

　　酒精肝和脂肪肝是人类重要疾病之一，酒精(乙醇)的摄入能使肝细胞的脂肪的代谢紊乱,造成肝内脂肪积聚,逐渐形成酒精性脂肪肝。另外，长期服用酒精性肝病者还常有肝内脂肪浸润和汇管周围区域病变。Lieber等[5]所做研究证实狒狒经过长期酗酒后,出现脂肪肝、肝纤维化，同时表现其肝细胞耗氧量下降,还可伴有线粒体的损伤。目前酒精灌胃对机体影响研究多为急性短期甚至短时实验，研究用法主要是大鼠胃管一次性酒精注射或酒精蒸汽吸入，这些方法不能准确地反映长期慢性的酗酒对机体的影响，本研究主要显示长期饮酒(5个月)对大鼠肝脏糖代谢相关指标和结构影响。因此，在本研究的动物模型处理中，采用长期胃管内灌注酒精法，持续5个月;同时胃管灌注避免了采用酒精随饮水自由摄入或与食物混合摄入时，动物对酒精的每日摄入量随动物饮水量或食量的改变而改变的缺陷。

　　本研究结果显示，长期酒精灌胃导致酒精肝等病变，并损害了多种能源物质代谢通路，改变了细胞结构。经过5个月酒精灌胃后，大鼠体重和肝脏重都有不同程度的变化，部分鼠胰岛素敏感性降低趋势，同时造成肝脏类似脂肪肝样组织学表现。目前有关酒精性肝病的组织学研究表明，大鼠酒精肝的形成时间可能比较早，其中脂肪肝出现最早，出现率也最高。形态学上表现为泡沫状特殊类型的小滴型脂肪化。酒精肝鼠空泡发生率明显高于正常鼠，脂肪空泡脂粒比较大[6]。研究中3个不同剂量酒精鼠肝脏均有不同程度脂肪变性，有密集或散在的脂滴空泡，间质成分少，肝细胞有时呈条索样排列，与文献结果类似[7]，且空泡的大小和密集程度以及组织结构间质情况与酒精灌胃剂量关系密切，灌胃量大者如C组空泡现象严重，细胞间隙相对较大。酒精鼠各组均呈汇管区炎性细胞明显聚集。有研究认为，持续慢性应用酒精，可发展为酒精性肝炎，还可以呈中央静脉周围肝细胞损伤形成气球样变、Mallory小体形成、灶性中性粒细胞和单核细胞浸润、肝细胞坏死等表现。

　　急性饮酒可造成低血糖[8]，研究表明，糖原是生物体内糖代谢能量储备重要关节点，是维持葡萄糖能量代谢的重要储存物质，酒精能引起肾上腺素释放，促糖原分解。酒精对糖代谢及机体营养状况有双重影响：肝糖原贮藏充足时，酒精可促进糖原分解及抑制葡萄糖的利用，使血糖升高;肝糖原贮藏不足时，酒精使糖异生受阻，甚至发生低血糖。长期大量饮酒还可导致还原型辅酶I/辅酶Ⅱ(NADH/NAD)比例增高以及酒精所致肝脏代谢紊乱，造成肝脏损害[9]。大量饮酒使糖耐量降低;而少量饮酒则对其影响甚微。本研究结果显示，长期酒精灌胃鼠的肝糖原含量显著降低，糖原染色也显示酒精鼠肝细胞内糖原颗粒密度降低、分布不均匀，符合了糖原物质减少的推测。另外，酒精灌胃5个月，大鼠体重减轻明显，呈肝糖原含量低下与体重下降同步正相关的关系，不排除长期大量酒精灌胃造成能量的营养吸收干扰、糖原储存下降和耗竭，机体营养状况变差因素。酒精可以抑制生长发育，影响胰岛素信号通路，长期应用酒精灌胃可通过干扰酒精代谢和清除率而影响多种维生素、营养素吸收[1012]，是大鼠体重和肝脏重量下降的另一原因。此外，长期酗酒虽然降低了大鼠体重和肝脏重量，但酒精损伤导致的酒精性肝脏脂肪变和糖的利用障碍(糖原含量下降)，又一定程度上增加机体发生胰岛素抵抗的机会。

　　本研究结果表明，肝脏糖原耗竭减少是酒精造成损伤的关键环节之一。其一，应用酒精提供了代谢能量但又干扰了正常营养物质的吸收，使能量代谢不足;其二，也是最关键的，长期饮用酒精可能对肝血管周围的肝细胞进行长期、反复的破坏加上营养消耗作用造成糖原水平显著下降，干扰正常糖原代谢通路，推测影响到能量储存利用多个代谢环节和酶的活性;同时造成细胞脱颗粒，空泡，间隙大以及脂肪粒的蓄积，成类似脂肪肝样变，个体上有可能出现高胰岛素水平，胰岛素抵抗倾向(HOMAIR变化)。总体量效分析提示，长期酒精灌胃降低大鼠肝脏糖原含量，肝组织形态学损伤表现都与酒精呈剂量依赖性，如实验中观察到的大剂量酒精对肝组织、糖原的影响最显著。这种剂量依赖关系对指导和评估酒精对机体的危害程度提供了详实依据。

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