慢性应激致抑郁模型大鼠红细胞促淋巴细胞增殖变化的研究

　　【关键词】 慢性应激 抑郁模型 大鼠 红细胞 促淋巴细胞增殖

　　The study of red blood cells on lyamphocyte proliferation in CUMS

　　GUAN Suzhen, WANG Qian, LIU Jiwen, et al

　　(Department of Occupational and Environmental Hygiene, College of Public Health,

　　Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China)

　　Abstract: Objective: Study the changes of rat red blood cells on T、B lyamphocyte proliferation in chronic unpredictable mild stress. Methods: 48 wistar rats were randomly divided into the control group and the depression group. To observe lyamphocyte proliferation changes of the red blood cells by MTT colorimetric and the associated behavioral performance was conducted. Results: Fourteen days after CUMS model, In the depression group, weight and organic coefficient of brain decreased in model group (P<0.01), a signifcantly reduced consumption of sucrose solutions, and increased consumption of pure water as compared with the control group (P<0.01). Plasma corticosterone levels peaked at the 7th day but in a declining trend after forteen days. The rate of red blood cells on T, B lymphocyte proliferation in depression group was lower than nonstress at 7, 14, 21 d. Conclusions: The repeated chronic mild stress stimulation can induce longtime changes in acts and activities and decrease the rate of T, B lyamphocyte proliferation in red blood cells, which can provide a new experimental method to observe the red blood cell immune function under the stress.

　　Key words: stress; depression; red blood cells; lymphocyte proliferation

　　应激属于防御适应性的反应，但当应激过于持久或强烈，超过了机体自身调节范围，就会引起神经、内分泌、免疫等多个系统功能的紊乱，诱发各种精神疾患，如抑郁症等[1]。免疫系统作为机体的防御屏障，对维持机体健康起着重要作用，而且最易受到外界有害因素的影响。自红细胞免疫的概念提出以来[2]，红细胞在免疫系统的重要作用已得到验证，有研究发现，红细胞具有刺激T、B细胞和NK细胞增殖，提高T细胞IL2分泌量等免疫效应[3]，证明了红细胞在免疫调控方面的作用。本研究采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测慢性应激致抑郁模型大鼠红细胞促淋巴细胞增殖反应，以探讨慢性应激状况下红细胞的免疫调控功能。

　　1材料与方法

　　1.1实验动物及分组Wistar雄性大鼠48只，体重180～200 g，由新疆医科大学实验动物中心提供，随机分为慢性应激致抑郁模型组(简称模型组)40只和正常对照组(简称对照组)8只，除正常对照组外均单笼饲养。

　　1.2方法

　　1.2.1CUMS模型制备慢性轻度不可预知性应激动物模型(chronic unpredictable mild strss CUMS)：参照Willner[4]设计的CMS动物模型基础上加以改动，该模型具有较好的信度和效度。采用6种应激方式：限制活动、明暗颠倒24 h、噪声(1 500 Hz，92 dB，1 h/d)、禁食24 h、禁水24 h、夹尾3 min(止血钳夹大鼠尾中部)，每天随机选一种应激方式，平均每种刺激被采用3次，同种刺激不能连续出现，使动物不能预料刺激的发生持续3周。对照组不予任何刺激，自由摄食饮水。

　　1.2.2行为学测定以大鼠穿越地面方格块数为水平运动得分，大鼠穿越1格(3爪以上跨入)为1分;以直立次数(2个前爪腾空或攀附墙壁)为垂直运动得分，每只大鼠进行1次，每次时间为3 min。

　　1.2.3液体消耗实验应激前先训练大鼠适应含糖饮水，每笼放置2个装有1%蔗糖水的小瓶，24 h后同时给予每只大鼠2瓶水(1瓶蔗糖水，1瓶纯水)，1 h后取走2瓶并称重[5]。实验前禁食、禁水24 h，其余操作同前。计算总液体消耗、糖水与纯水消耗、糖水偏爱百分比(偏爱百分比=糖水消耗/总液体消耗×100%)。

　　1.2.4血浆皮质酮水平测定放射性免疫法测定血浆皮质醇的含量，125I皮质醇放射免疫测定盒(北京北方公司)。检测结果中皮质酮含量由皮质醇测定值换算得来[6]，换算公式:皮质酮浓度=皮质醇浓度×50(注:皮质酮是啮齿类动物主要的糖皮质激素，大鼠血浆皮质酮与皮质醇含量比恒定，约为50∶1)。

　　1.3红细胞诱导淋巴细胞增殖试验

　　1.3.1取血应激前1 d，随机抽取模型组大鼠8只，行乙醚麻醉后，腹主动脉无菌取血，用于制备淋巴细胞1 ml、红细胞悬液1 ml。同样的方法在应激后1、7、14 d，分别随机抽取8只模型组大鼠无菌取血。应激21 d后全部动物取血。

　　1.3.2淋巴细胞悬液的制备无菌抗凝血1 ml，用1 ml Hanks液稀释，小心叠加于等体积的淋巴细胞分离液，2 000 r/min离心20 min，吸出上、中层之间白色云雾状的淋巴细胞入离心管，DHanks液洗涤3次(1 000 r/min，10 min)，最后一次离心前将淋巴细胞悬液吸出0.1 ml，台盼蓝染色计数细胞，细胞活力在95% 以上，用完全1640液调至4×106/ml。

　　1.3.3红细胞悬液的制备无菌抗凝血1 ml，2 000 r/min离心20 min，吸取下层红细胞用DHanks 洗涤3次，用完全1640液调至 1.25×107/ml。

　　1.3.4淋巴细胞增殖反应(MTT法)取96孔培养板，试验设5个组，实验组1为红细胞+淋巴细胞+脂多糖，实验组2为红细胞+淋巴细胞+植物血凝素，对照组1为淋巴细胞+脂多糖，对照组2为淋巴细胞+植物血凝素，空白对照组为完全1640组。将淋巴细胞接种细胞培养板，其中试验组和对照组淋巴细胞接种量为100 ul，丝裂原和红细胞悬液加人量均为50 ul，每孔总量为200 ul，不足的用完全1640补足。空白对照组为完全1640。以上均设3个复孔。于5%CO2，37℃培养48 h后，加入MTT20 μl/孔，继续培养4 h。取出反应物小心吸弃上清，各孔中加入150 μl DMSO，于振荡器上振荡30 s，待结晶全部溶解，用酶标仪于540 nm处测定吸光度(A)值。红细胞促B淋巴细胞增殖率=(实验组1 A 空白组A)/(对照组1 A 空白组A)红细胞促T淋巴细胞增殖率=(实验组2 A 空白组A)/(对照组2 A 空白组A)1.4统计学处理采用SPSS13.0软件进行统计分析，组间比较采用t 检验，检验水准α=0.05。

　　2结果

　　2.1大鼠体重及大脑系数的变化随着应激天数的延长，模型组大鼠体重增长减慢,大脑系数明显减小，与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.01)。

　　2.2两组大鼠血浆皮质酮水平的比较在未给予任何刺激时，模型组与正常对照组比较，血浆皮质酮水平差异无统计学意义。模型组在给予慢性应激7 d后达高峰(P<0.01)，提示模型组大鼠处于应激状态。但在应激14 d后其血浆皮质酮水平有下降的趋势，说明随着应激时间的再延长，HPA轴功能将趋向于适应(表1)。表1两组大鼠血浆皮质酮水平的比较(ng/ml, ±s)组别应激前1天应激后第7天第14天第21天正常对照组183.02±10.58208.23±30.24218.50±16.85209.83±9.64模型组178.14±17.16238.56±31.12349.89±13.01**253.73±22.56**注：与同一时间点的正常对照组相比， *P<0.05， **P<0.01 2.3两组大鼠行为学的比较随着应激时间的延长，模型组大鼠水平运动及垂直运动得分较对照组均明显降低(P<0.05～0.01)(表2)。

　　2.4两组大鼠液体消耗情况的比较两组基线总液体消耗各指标差异均无统计学意义(P>0.05)。应激7天后，模型组大鼠1%蔗糖偏爱百分比明显低于对照组(P<0.01)，纯水消耗明显高于对照组(P<0.01);应激14天后，模型组糖水消耗量、1%蔗糖偏爱百分比明显低于对照组(P<0.01)，而纯水消耗量显著高于对照组(P<0.01)，提示模型组大鼠进入抑郁状态(表3)。表2两组大鼠行为学指标的比较(±s)指标组别应激前1天应激后第1天第7天第14天第21天水平运动得分对照组54.83±6.9445.75±11.2647.08±20.8353.00±9.8337.83±11.72模型组54.68±6.1541.74±7.8624.89±8.94**18.31±12.04**21.17±12.61*垂直运动得分对照组21.42±6.2311.83±4.8418.00±7.9116.33±9.8316.67±4.73模型组21.16±3.097.79±3.31**9.63±4.41**7.31±4.23**10.17±4.21*注：与同一时间点的正常对照组相比， *P<0.05， **P<0.01表3两组大鼠液体消耗情况的比较(±s)指标组别应激前1天应激后第1天第7天第14天第21天纯水消耗(ml)对照组2.80±1.852.30±1.142.50±1.573.00±1.423.30±1.28模型组3.06±1.592.50±1.012.98±0.776.23±1.04**6.57±1.62**糖水消耗(ml)对照组5.00±1.146.65±3.647.00±1.428.10±2.138.20±1.99模型组4.79±2.473.83±1.86**6.96±1.023.69±1.63**3.43±1.13**总液体消耗(ml)对照组7.80±2.718.95±2.789.50±2.9911.10±1.5611.50±2.27模型组7.85±2.706.32±1.46**9.94±1.269.92±1.9711.00±1.831%蔗糖偏爱百分比对照组64.45±7.6674.27±12.6673.85±13.2353.54±11.9871.26±10.72模型组61.21±15.5061.05±11.2371.04±19.2137.84±11.34*31.21±16.56**注：与同一时间点的正常对照组相比， *P<0.05， **P<0.012.5红细胞促淋巴细胞增殖变化随着应激时间的推移，模型组大鼠较正常对照组红细胞促T、B淋巴细胞增殖率降低，且在应激后第7、14、21天后，与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.01)。提示随着应激天数的增加，其红细胞抑制T、B淋巴细胞增殖的作用也越来越明显。

　　表4红细胞促淋巴细胞变化(±s)组别红细胞促T淋巴细胞增殖率红细胞促B淋巴细胞增殖率正常对照组1.70±0.151.54±0.24模型组应激前1天1.73±0.131.52±0.17应激后第1天1.69±0.221.48±0.16第7天1.40±0.09**1.22±0.06*第14天1.21±0.25**1.08±0.10**第21天0.96±0.13**0.81±0.21**注：与模型组应激后第1天比较， *P<0.05， **P<0.013讨论慢性应激可以诱发抑郁症，现国内外广泛接受的一类是慢性应激抑郁模型CUMS，衡量CUMS的重要指标就是快感缺失，Yadid等[7]将液体消耗实验中糖水的消耗量和糖水偏爱百分比作为测量快感缺乏的有效的客观指标。本实验结果显示，慢性应激14天后，模型组大鼠水平和垂直运动得分低于对照组，随应激时间的延长，得分明显降低。在液体消耗实验中，模型组大鼠在应激14天左右其糖水消耗及1%蔗糖偏爱百分比较对照组明显下降，并一直持续到造模结束，提示大鼠出现快感缺失。因此，本次建立的动物应激模型可很好的模拟人类抑郁症的核心症状——快感缺失。红细胞已被证实是体内数量最多的一种免疫细胞，它不仅具有识别和储存抗原，清除血液循环中免疫复合物的作用，还参与机体免疫调控。淋巴细胞是机体的重要免疫细胞，淋巴细胞转化实验是检测淋巴细胞增殖活性的一种有效的方法。淋巴细胞在中枢淋巴器官发育成熟后，经血流迁移到外周淋巴器官发挥各种生物学功能，在迁移过程中淋巴细胞会与红细胞不断接触，与红细胞释放到外周血中的免疫活性分子相互作用，促进其增殖转化[3]。本试验中分别用红细胞悬液配合两种不同的丝裂原——脂多糖(LPS)及植物血凝素A(PHA)刺激应激致抑郁模型大鼠淋巴细胞增殖分别用于评价B淋巴细胞和T淋巴细胞增殖能力，前者可反映体液免疫功能，后者可反映细胞免疫功能[8]。此实验结果显示模型组各应激时程下红细胞悬液协同PHA、LPS丝裂原刺激T、B细胞增殖反应率明显低于对照组。Horuk等[9]研究显示，红细胞促淋巴细胞增殖作用是通过红细胞膜上LFA3与淋巴细胞膜CO2的相互作用，促使T淋巴细胞活化及产生淋巴因子，红细胞通过LFA3/CO2以及CR1CIC/TCR对T细胞粘附，激活T细胞增殖。造成本实验结果的原因可能在于应激使机体分泌一些物质使血液中免疫复合物增多，可覆盖于红细胞膜上，妨碍红细胞膜上LFA3与CD2及其它配体受体的结合。也可能在于应激使红细胞膜上LFA3减少，从而影响了红细胞激活T细胞增殖的能力。本研究结果表明，红细胞悬液促进机体细胞免疫和体液免疫的功能在应激下而减弱。因此可以通过观察应激状况下红细胞促淋巴细胞变化情况来判断机体红细胞免疫功能状况。

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