降脂药辛伐他汀对大鼠成骨细胞代谢的影响

　　【摘要】 目的 探讨降脂药辛伐他汀对大鼠成骨细胞代谢的影响。方法 分离培养2周龄乳鼠成骨细胞，传代后以辛伐他汀作干预，观察成骨细胞的成骨代谢中碱性磷酸酶(ALP)及骨形态发生蛋白(BMP-2)表达的改变。结果 成骨细胞传代后辛伐他汀可明显增强干预组的ALP及BMP表达水平，使其与对照组呈现明显差异(P<0.01)。结论 辛伐他汀能够明显提高大鼠成骨细胞的成骨代谢指标的表达，表明其具有成骨促进作用。

　　【关键词】 辛伐他汀 成骨细胞 代谢

　　The Effects of Simvastatin on the Metabolism of Rat Osteoblast

　　Zhong Haihong.

　　(Surgical Department of The First Clinical Institute of Guangdong Medical Collge,Zhanjiang,Guangdong 524001)

　　【Abstract】 Objective To investigate the effects of simvastatin on osteoblast metabolism.Methods Osteoblasts of rats birth after two weeks were isolated and cultured in vitro,and then were interfered with simvastatin,the expression of ALP and BMP-2 were tested.Results The expression of ALP and BMP-2 in osteoblast cultured 4 generations were highly exceeded the control group after interfered by the simvastatin.The expressions between the two group had significantly difference (P<0.01).Conclusions Simvastatin can significantly increase the ALP and BMP-2 expression of the osteoblast; this indicates it can promote osteoblastic effect of bone cells.

　　【Key words】 Simvastatin Osteoblast Metabolism

　　骨质疏松症已经成为一种日益严重的公共健康问题，他汀类药物目前主要应用于降低胆固醇，抑制心血管疾病，它可抑制羟甲基戊二酰辅酶A还原酶，从而降低肝脏胆固醇的合成,而甲羟戊酸可阻断荧光素酶活性，骨的形成作用与此酶的抑制有关。Mundy 等人[1]提出，广泛应用于防治心血管疾病的药物-他汀类降血脂药同时具有预防骨质疏松症及骨折发生的作用，具有一定的临床应用潜力，从而该方面的研究也逐渐成为近年来骨修复研究的热点。本文应用大鼠成骨细胞为研究对象，观察在他汀类药物的作用下其成骨代谢相关指标的改变。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要实验材料与试剂 Hank液，DMEM培养液(Hyclone公司),胎牛血清((杭州四季青生物制剂公司)，胶原酶、胰蛋白酶(Sigma公司)，辛伐他汀(默沙东制药有限公司)，ALP检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)，BMP-2免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

　　1.2 成骨细胞的分离与培养 采用胰蛋白酶和胶原酶(Ⅱ型)消化法，取2 周龄乳鼠的颅盖骨，去除其表面的软组织，用Hanks液洗3次，剪碎，用0.25%胰蛋白酶和0.02%Ⅱ 型胶原酶在37℃下振荡，时间分别为20、40和90min，弃去前两次消化液和细胞，收集第三次消化所得细胞，用含10%胎牛血清的DMEM液培养传代。取第4-5代细胞用作实验。

　　1.3 成骨细胞培养基中ALP的检测 成骨细胞上清液碱性磷酸酶(ALP)含量测定：将传代细胞以1×104/ml密度接种至24孔板，24h后培养液中加入1.0umol/l浓度的辛伐他汀，继续培养3d，刮下细胞，以PBS液洗1遍，加入0.5ml体积分数为0.1ml/100ml TritonX-100，4℃冰箱放置过夜，用ALP检测试剂盒在生化仪上测定成骨细胞内ALP活性测定。

　　1.4 成骨细胞中BMP-2的检测 BMP-2免疫组化染色:细胞消化传代，以1×104/ml密度接种于铺有盖玻片的培养皿制作细胞爬片，加入1.0umol/l浓度的辛伐他汀培养24h。加入羊血清工作液(2%羊血清/0.3%TritonX-100/0.1%BSA溶于PBS)封闭，室温下10min，切片勿洗，加入兔抗BMP-2多克隆抗体，4℃过夜;加入生物素化山羊抗兔IgG，室温下孵育30min;加入辣根酶标记的链霉亲和素，室温下孵育30min;DAB显色;苏木素复染;常规脱水、透明、封片。

　　阳性结判断：BMP-2在细胞浆内表达，阳性反应呈棕黄色或黄色。每张玻片选2个视野(×400)，应用Olympus生物显微镜做成骨细胞总数和阳性计数;每组玻片取其平均值。

　　2 结果

　　实验组成骨细胞受辛伐他汀干预后，ALP与BMP-2的表达情况见表1、2。从表1可以看出在1.0umol/L的辛伐他汀作用72h后，与空白对照组相比实验组的ALP表达呈明显升高，达到(210±40)u/L，为空白对照组的近1.5倍，统计学上呈明显的差异，P<0.01。在相同细胞数中BMP-2阳性表达细胞的百分数实验组为98.3%，显著高于对照组，统计学差异明显(P<0.01，见表2)。这表明在辛伐他汀干预下成骨细胞代谢过程中，成骨性指标ALP与BMP-2均呈现高表达，说明其成骨能力增强。

　　表1 两组大鼠成骨细胞ALP的表达(略)

　　注：P<0.01。

　　表2 两组大鼠成骨细胞BMP-2的表达(略)

　　注：P<0.01。

　　3 讨论

　　随着人口的老龄化，骨质疏松的发病率也越来越高，我国60岁以上人群的发病率已达10%，对骨质疏松的预防和治疗越来越引起学者们的重视。骨质疏松症的药物治疗大体从两个方面入手：一种应用抑制骨吸收的药物,如二膦酸盐、雌激素、降钙素等;另一种是应用刺激骨形成的药物，如氟化物、甲状旁腺素等。近年来对降脂药他汀类药物的研究，发现以辛伐他汀为主的他汀类药物可刺激体外培养的成骨细胞增殖和分化，他汀类药物促进骨形成作用与降脂作用无关，属于非降脂作用。老年性骨质疏松的发病与成骨细胞的功能下降或凋亡有关，促进成骨细胞的增殖和功能是治疗骨质疏松症的一条重要途径。由于目前临床骨质疏松症用药治疗主要是抑制骨吸收，缺乏有效的促骨质合成代谢的药物来解除患者已有的骨折危险，而他汀类药物可通过促进骨形成增加骨密度，因此具有很大的研究开发价值，使它可能成为新的有效治疗骨质疏松症的药物。

　　辛伐他汀是一种无活性内酯，吸收后的分解产物是羟甲基戊二酰辅酶A(HMGCoA)还原酶的抑制剂，能够有效地降低肝脏胆固醇的合成[2]。甲羟戊酸可阻断荧光素酶活性，骨的形成作与此酶的抑制有关[3]。

　　ALP是成骨细胞分化的早期指标之一，其表达随着细胞分化的发展而增强，作用是水解有机磷酸释放出无机磷而作用于羟磷灰石的形成，是骨形成所必需的酶，它的表达代表着骨形成的状况，表明细胞分化和骨组织形成的开始。因此ALP是成骨细胞生长和发育早期的重要标志，同时是成骨细胞的功能状态的体现，是骨形成的指标。碱性磷酸酶作为成骨细胞的一种特异表型，在骨细胞群中ALP活性增高提示细胞的高分化状态，ALP与成骨细胞的分化有关，因此ALP增高在体外实验中作为成骨细胞分化的指标[4]。本文结果表明，受辛伐他汀作用72小时后，成骨细胞碱性磷酸酶活性明显增高，呈剂量依赖关系，这说明辛伐他汀有明显增加成骨细胞功能，对骨形成可能具有促进作用。实验组中ALP含量明显高于对照组，差异显著(P<0.01)。有文献报道辛伐他汀能够明显提高培养液中羟脯氨酸的含量，提示辛伐他汀明显刺激成骨细胞I型胶原的合成，这从另一方面说明了它对成骨细胞的促分化作用[5]。

　　BMP-2是目前发现的既能促进成骨细胞分化又能促进成骨细胞增殖的细胞因子之一。BMP-2不仅能够促进成骨细胞及其前体细胞的增殖，还可促进骨髓基质细胞向成骨细胞的分化[6-7]。文献报道，rhBMP-2可诱导活体成骨细胞前体细胞的分化[8]。本文结果表明在辛伐他汀作用72小时后，大鼠成骨细胞中的BMP-2表达增强，这种增强与ALP活性升高呈正相关，而对照组无辛伐他汀的作用BMP-2表达水平明显低于实验组，说明他汀类药的这种作用对成骨细胞的成骨能力增强有密切关系。但他汀类药促进BMP-2分子表达的具体机理尚不清楚，有人认为可能是通过旁分泌或自分泌作用刺激成骨细胞发挥成骨功能的。

　　可见辛伐他汀体外可明显促进成骨细胞的成骨活动，但该过程的具体机制尚未得到阐明。因此在用于骨质疏松治疗还有一段很长的路要走，对于药物的作用机制、给药方式等方面均需作进一步的深入研究。

　　参考文献

　　[1] Mundy G,Greet R,Harris S,et al.Stimulation of bone formation in vitro and in rodents by statins[J].Science,1999，286:1946-1949

　　[2] Law MR,Wald NJ,Thompson SG.By how much and how quickly does reduction in serum cholesterol concentration lower risk of ischaemic heart disease[J].Br Med J,1994，308:367-372

　　[3] Rao S,Porter DC,Chen X,et al.Lovastatin mediated G:Arrest through inhibition of the proteasome-independent of hydroxymeth glutaryl-CoA reductase[J].Proc Natl Acad Sci USA,1999，96:7797-7802

　　[4] Liu P,Oyajobi BO,Russell RG,et al.Regulation of osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells:Interaction between transforming growth factor-beta and 1,25(OH)2 vitamin D3 in vitro[J].Calcif Tissue Int,1999，65(2):173

　　[5] Richard DJ,Sullivan TA,Shenker BJ,et al.Induction of rapid osteoblast differentiation in rat bone marrow stromal cell culture by dexamethasone and BMP-2[J].Biol,1994,161:218-221

　　[6] Wozney JM.Bone morphogenetic proteins and their gene expression.In:Masaki Noda.Cellular and molecular biology of bone[J].Sanbiego,California:Academic Press INCPressed,1993:132-157

　　[7] Thies RS,Bauduy M,Ashton BA,et al.Recombinant human bone morphogenetic protein-2 induces osteoblastic differentiation in W-20-17 stromal cells[J].Endocrinology,1992，130(3):1318

　　[8] Zerath E,Holy X,Noel B,et al.Effects of BMP-2 on osteoblastic cells and on skeletal growth and bone formation in unloaded rats [J].Growth Horm IGF Res,1998,8:141-149