试说分光光度法测定叶片叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量

　　摘要：本文介绍了一则综合化学和生物知识的学生科技活动，通过测定植物叶片中叶绿素和类胡萝卜素含量，分析它们与植物生长状况的关系，培养学生科学素养。
　　
　　关键词：叶绿素；类胡萝卜素；含量测定；分光光度法
　　
　　光合作用是植物所特有的生理功能，是地球上最大规模地将太阳能转换为化学能，并利用它把CO2和H2O等无机物合成为有机物同时放出O2的过程，是“地球上最重要的化学反应”。光合作用为人类、动植物及微生物的生命活动提供了有机物、O2和能量。
　　
　　太阳能是通过光合色素来吸收的，光合色素存在于叶绿体中。高等植物叶绿体中所含的光合色素包括叶绿素(主要有叶绿素a和叶绿素b)和类胡萝卜素(包括胡萝卜素和叶黄素)。叶绿素由卟啉环和叶醇组成，卟啉环的中央有一个镁原子，叶绿素a的分子式为C55H72O5N4Mg，叶绿素b的分子式为C55H70O6N4Mg。
　　
　　胡萝卜素是一种不饱和碳氢化合物，分子式为c柏H56， 叶黄素是胡萝卜素含氧的衍生物，分子式为c柏H56O2。各种植物叶片中叶绿素和类胡萝卜素都可溶于丙酮、乙醇、石油醚、四氯化碳等溶剂。叶绿素是植物吸收光能的主要色素，类胡萝卜素在光合作用中的作用是辅助性质的，它们吸收的光能只有传递给叶绿素之后才能在光合作用中发挥作用。叶片中光合色素含量不同，会影响植物光合效率，还引起叶片颜色的变化。叶绿素a呈蓝绿色，叶绿素b是黄绿色，一般情况下类胡萝卜素的颜色被叶绿素所掩盖，在秋天叶绿素分解时才呈现出来，由于叶片所含叶绿素和类胡萝卜素的比例不同，所以秋季是植物叶片颜色多样的季节。
　　
　　在学生科技活动中进行植物活体叶片叶绿素和类胡萝卜素含量的测定，可以激发他们探索大自然奥秘的兴趣，培养综合利用多学科知识分析问题和解决问题的能力，增强学习的积极性、主动性和实际动手能力，体现素质教育的特点。
　　
　　1 原理
　　叶绿素和类胡萝卜素在90％丙酮提取液中的最大吸收峰波长不同，可以用分光光度法在提取液中分别测出叶绿素a(最大吸收波长为662nm)、叶绿素b(最大吸收波长为644nm)和类胡萝卜素(最大吸收波长为440nm)的吸光度值A。利用下式进行浓度计算[1]：
　　叶绿素a浓度(mg／L)：
　　Ca=9．78×A662—0．99×A644 (1)
　　叶绿素b浓度(mg／L)：
　　Cb=21．43×A644—4．65×A662 (2)
　　叶绿素总浓度(mg／L)：
　　Ca+b=Ca+Cb=5．13 x A662—2O．44 x A644 (3)
　　类胡萝卜素浓度(mg／L)：
　　Ck =4．7×A440一o．27 ×Ca+b
　　 =4．7×A440一(1．38×A662+5．48×A644)(4)
　　
　　2 材料和方法
　　在9月中旬取5组叶片(每组5—7片叶片)，分别为樟树(Cinnmomum camphora)嫩叶(淡绿色)、樟树功能叶(深绿色)、樟树老叶(红色)、珊瑚树(Viburnum odoratissimum)功能叶和七子花(Heptacodi．um miconioide5)功能叶(也可选取其它植物的叶片)，各组叶片用不锈钢剪刀剪成4mm2左右的碎片，混匀，用分析天平准确称取0．5g左右，分别放入50mL锥形瓶中，加20mL蒸馏水，少量CaCO3粉末(防止脱镁)，用高速电动匀浆机制成匀浆，定容至25mL，准确量取2．5mL，加入到50mL的试剂瓶中，再加入22．5mL无水丙酮，加塞，暗中提取光合色素30min，滤纸过滤，取滤液，即为90％丙酮光合色素提取液。
　　
　　90％ 丙酮提取液中叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素浓度的测定：用90％丙酮作空白，用7200可见分光光度计测定提取液在440nm、644nm和662nm处的吸光度值(A)，代人公式(1)～(4)计算提取液中叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的浓度。叶片中光合色素含量的计算：以下式分别计算叶片中叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量(mg／g鲜重)。
　　
　　X = 25 × 10_3 × C × 10 ／ W = 0．25× C ／ W （5）
　　式中：X－叶片中某种光合色素含量(mg／g)
　　C－提取液中某种光合色素浓度(me／L )
　　W－分析样品的鲜重(g)
　　
　　3 结果与讨论
　　测得各种叶片中叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素的含量。从中可以看出，樟树不同叶龄叶片光合色素含量不同，功能叶类胡萝卜素含量较高，嫩叶和老叶类胡萝卜素含量较低。
　　
　　嫩叶叶绿素含量低，颜色浅(淡绿色)，功能叶叶绿素含量较高，颜色较深(深绿色)，而老叶叶绿素大量分解，含量很低，含量相对较高(与叶绿素相比)的类胡萝卜素使得叶片变红。叶片中叶绿素稳定性比类胡萝卜素差，容易受环境条件和植物本身生理状况的影响而发生变化。同是功能叶的光合色素含量，在不同树种中是不同的，这是由植物的遗传特性所决定，还与植物生存的环境有关。光合色素的功能是吸收光能，为植物的光合作用提供能量。植物叶片叶绿素含量与光合速率、营养状况等密切相关，实践上常测定叶绿素含量以表征植物生长状况，也往往把叶色变化作为看苗诊断和肥水管理的重要指标。