墓头回提取物作用白血病K562细胞蛋白双向电泳方法的建立

　　0 引言
　　
　　蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象的学科，1937 年Tiselius 改进了Reiner 的方法，提出利用电泳技术分析复杂混合物的蛋白质，例如血清蛋白质【1】，双向电泳技术已被广泛应用到生命科学的各个领域，如细胞生物学【2】、神经生物学等。双向电泳【3,4】作为蛋白质组研究的三大关键核心技术之一，仍然是目前分析组份复杂蛋白质分辨率最高的工具，蛋白质组学所应用的核心技术包括样品制备、分离、质谱分析和生物信息分析，而双向凝胶电泳分离蛋白质的关键是组织或细胞样品的制备，即蛋白质的提取，目前常用的方法有一步提取法（采用单一裂解液和单一的裂解步骤），由于目前的蛋白质样品制备方法获得的样品中往往含有干扰物质（如盐离子、核酸、脂类和多糖等）和溶解不完全等缺陷，因此还需要盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法对蛋白样品进行纯化，本实验在标准裂解法得到蛋白的基础上，采取丙酮沉淀法和三氯乙酸 /丙酮沉淀法纯化蛋白质，制备K562 细胞的蛋白样品，并在IEF 电泳过程中对传统电泳条件进行改良，通过比较不同提取方法所得蛋白质和改良传统聚焦条件后的双向电泳图谱，优化了K562 细胞双向电泳样品制备的方法。
　　慢性髓细胞白血病(CML)是起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病，大量研究提示，CML细胞抗凋亡能力的增强是其发病的主要原因，也是CML 细胞耐受化疗而不能被彻底清除的主要因素之一【5,6】，K562 细胞作为一种慢性髓细胞白血病细胞系的一种，它的相关研究对临床血液系统肿瘤的攻克意义重大。因此本文采用裂解法基础上的有机溶剂沉淀法纯化白血病K562 细胞总蛋白，进行2-DE,通过比较2- DE 图谱，选择适合K562 细胞的蛋白提取和纯化的方法，同时本文运用此方法成功建立了中药墓头回干预的K562 细胞、S180 小鼠肿瘤组织的双向电泳图谱，为进一步软件分析寻找差异点，质谱分析差异点蛋白奠定基础。
　　
　　1 材料与方法
　　
　　1.1 材料
　　1.1.1 细胞株
　　人慢性粒细胞白血病(CML)细胞系 K562 细胞株为本实验室常规培养。
　　1.1.2 墓头回
　　墓头回提取物经醇煎、萃取、蒸馏、干燥等过程而制成。
　　1.1.3 瘤组织
　　S180 瘤组织为本实验室S180 肿瘤小鼠模型保存。
　　1.1.4 主要试剂
　　尿素、硫尿、三羟甲基氨基甲烷(Tris)，3-[(3-胆酰胺丙基 )-二乙胺 ]丙磺酸 (CHAPS)、十二烷基磺酸钠(SDS)，二硫苏糖醇(DTT)、三氟乙酸四甲基乙二胺(TEMED)、乙二胺四乙酸（EDTA），PMSF(Sigma 公司) 两性电解质(Ampholine)丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸胺、碘乙酰胺、考马斯亮蓝G-250 和甘油为Sigma 公司产品；其余药品丙酮、三氯乙酸（TCA）均为国产分析纯试剂。
　　1.1.5 主要设备
　　PROTEAN IEF Cell 系统和PROTEANⅡxi 系统，Milli2Q 超纯水系统(Millipore 公司)，MICRO17TR 高速低温离心机(Hanil 公司)。
　　
　　1.2 试剂配制
　　裂解液：7M 尿素、2mol/ L 硫脲、4%CHAPS、40mmol/LTris、5mmol/LPMSF 65mmol/LDTT(现加),0.2%（w/v）bio-lyte、- 70 ℃保存。平衡液1:参照双向凝胶电泳说明书配制平衡母液,使用时每5ml 的平衡母液中加入100mg DTT。平衡液2：使用时每5ml 的平衡母液中加入碘乙酰胺125mg。 20 %三氯乙酸/丙酮沉淀液：TCA10g 丙酮40ml DTT0.05g 定容至50ml。Bradford 工作液：乙醇0.05ml、磷酸（85%）1.04ml、考马斯亮蓝G-250 0.007g、定容至10ml。上样缓冲液以及12.5%凝胶液均参照双向凝胶电泳说明书配制。
　　
　　1.3 样品处理
　　K562 细胞培养于含10%灭活(56℃,30 min)小牛血清的 RPMI 1640 培养液中,培养液含NaHCO3 2.0 g/L、青霉素100 U/mL、链霉素100 U /mL。置于37℃、5%CO2 培养箱内培养，细胞生长到合适密度后，采用下列方法制备电泳样品后 ,使用Bradford 的方法测定样品中蛋白浓度。
　　1.3.1 标准裂解法（方法1）：
　　培养悬浮 K562 细胞，细胞计数器计数后，调整浓度为1×107 /ml 离心K562 悬浮细胞后，用预冷的PBS 洗细胞3 次，1500ｇ离心10 分钟，弃上清，重复3 次。然后每1×107 细胞加1 ml 裂解液(7mol/ L 尿素、2mol/ L 硫脲、4%CHAPS, 40mmol/LTris 现加65 mmol/ L DTT、5mmol/LPMSF 和0.5 % (V/ V) Bio-Lyte , pH 3～10)或加入5 倍体积裂解液,放于冰上静置裂解30 min ,液氮反复冻融三次，加入RNase 50ug/ml、DNase 200ug/ml 4℃放置15 分钟，超声破碎细胞，300w，工作3s，间歇2s, 24 个循环,4℃,16000 r/min 离心 1h，取上清，分装储存于-70℃保存【7】。
　　1.3.2 丙酮沉淀法（方法2）：
　　4 倍体积-20℃预冷丙酮（-20℃放置1h）加入标准裂解法所得蛋白中，-20℃静置过夜，4℃，16000r/min 离心1 h，弃上清丙酮液，所得沉淀用80 %，100 %冷丙酮各洗一次，-20℃放置挥发丙酮后得到蛋白质干粉。加裂解液充分溶解蛋白质沉淀，4℃ 16000r/min 离心30min，取上清，分装- 70℃ 保存【8】。
　　1.3.3 三氯乙酸 /丙酮沉淀(TCA/丙酮)（方法3）：
　　标准裂解液所提取蛋白中加入4 倍体积20 %三氯乙酸/丙酮溶液(三氯乙酸溶于丙酮，含0.1%DTT)，1:1 (V / V ) 混合,-20℃过夜，然后15℃、16000r/min 离心1h，倾去上清；用含0.1 %DTT 的冰丙酮漂洗蛋白质沉淀3 次，去除三氯乙酸；挥发残余的丙酮后，加裂解液充分溶解蛋白沉淀；然后4℃，16000r/min 离心30 min，取上清，分装-70℃ 保存【9,10】。
　　
　　1.4 蛋白浓度测定
　　1.4.1 牛血清白蛋白（BSA）标准曲线
　　采用 Bradford 法定量【11】以牛血清白蛋白为标准蛋白制作标准曲线：在六只离心管中各加入1mg/ml BSA 蛋白标准溶液各0、5、10、15、20、25μl，然后分别对应加入0.9%生理盐水100、95、90、85、80、75μl，使终体积为100μl，混匀，分别配制成一系列不同浓度的BSA 溶液。以上各管均加入Bradford 工作液1ml，混匀后，每管取200μl 加入96 孔板，每种浓度设三个平行孔，静置3 min，测定A570 值，重复三次，取其平均值。以不同浓度的BSA 蛋白0-25μl 为横坐标，A570 的平均值为纵坐标，绘制标准曲线(图1)。
　　1.4.2 K562 细胞蛋白浓度测定：
　　分别取三种方法所得蛋白溶液1μl，各管再加0.9%生理盐水99μl 和Bradford 工作液1ml，所得溶液取200μl 加入96 孔板，每管设三个平行孔静置3 min 后测定A570 值，重复三次，取其平均值, 三种提取蛋白方法1，2, 3 所得蛋白吸光度均值分别为0.440,0.378,0.346。根据标准曲线所得方程：y=0.0267x+0.2609 计算得：方法1 所得蛋白浓度为6.7078ug/ul，方法2 所得蛋白浓度为：4.3857ug/ul，方法3 所得蛋白浓度为：3.1873ug/ul。
　　
　　1.5 双向凝胶电泳
　　1.5.1 第一向等电聚焦电泳
　　将预制好的第一向凝胶（7cm，pH 3-10）组装到电泳槽上，从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液（7M 尿素、2mol/ L 硫脲、4%CHAPS、65mmol/L DTT、0.2%（w/v）bio-lyte，PH 3-10、0.001%溴酚蓝）融化，取含 200μg 蛋白质的上述蛋白质提取液 ,补充上样缓冲液至150ul,充分混匀。冰箱取-20℃冷冻保存的 IPG 预制胶条（7cm pH 3-10），于室温放置10分钟。将所有的蛋白质样品加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG 胶条上的保护层。在每根胶条上覆盖 2-3ml 矿物油，对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序，除盐聚焦条件开始采用传统(标准)升压聚焦条件(17℃,50 V 12 h, 250V 30min, 500V30min, 4000V 线性升压3 h, 4000V 聚焦20000v h，500 V 保持任意时间)。经改良后升压聚焦条件(17℃,50 V 12 h, 250V 1h, 500 V 1h, 4000 V 线性升压4 h, 4000V 聚焦20000v h，500V保持任意时间)。等电聚焦结束后，从电泳槽中取出胶条，双蒸水冲洗胶条，置胶条于平衡液1(胶条平衡缓冲母液5ml DTT 100mg，DTT 用时现加)中浸泡并摇床震荡15 min；用润湿的滤纸吸掉胶条上多余的平衡液。后续将胶条浸泡于平衡液2（胶条平衡缓冲液母液5ml 碘乙酰胺125mg 用时现加）中浸泡并摇床震荡15min 用润湿的滤纸吸掉胶条上多余的平衡液。
　　1.5.2 二向 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳
　　第一向等电聚焦凝胶经过平衡后，将 IPG 胶条从样品水化盘中移出，使胶面完全浸末在1×电泳缓冲液中，然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触，在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电泳槽中进行第二向电泳；电泳参数设置：（参照伯乐公司双向电泳实验手册），在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用的低电压（80v）待样品在完全走出 IPG 胶条，浓缩成一条线后，再加大电压（120v），待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。分别扫描得到一步裂解法和后续两种沉淀纯化方法所得凝胶图2（A,B,C）以及优化聚焦条件后的电泳。为了验证上述优化条件的的适用性，分别提取墓头回干预白血病K562 后的细胞蛋白质和S180 小鼠瘤组织蛋白质进行双向电泳，结果显示此方法大大减少了盐离子对图谱的干扰，蛋白质点清晰，无明显拖尾,提高了后续寻找差异点蛋白的准确性。
　　
　　2 讨论
　　二维凝胶电泳 ( Two- dimensional gelelectrophoresis,2-DE)是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，而组织细胞蛋白质的抽提，则是该技术的关键，选择合适的样品制备方法对获得满意的二维电泳图谱非常重要。
　　在本研究中，我们用分级提取步骤比较了标准裂解法，和此基础上的三氯乙酸/丙酮沉淀法和丙酮沉淀法处理样品后进行的双向电泳后的图谱。如所示，标准裂解法所提取蛋白所得的蛋白浓度高，但分离蛋白点较少，高丰度蛋白的分离与其它两种方法差别不大，但在低丰度蛋白的表达上，其它两种方法要优于标准裂解法。
　　方法2 三氯乙酸/丙酮沉淀法对样品处理后进行双向电泳分析发现，此处理方法会造成蛋白质的大量丢失，在双向电泳图谱上表现为蛋白点的数量较少。这是因为根据TCA 沉淀蛋白的作用机制, 对碱性蛋白的富集效果较好, 但对等电点小于溶液 pH 值的酸性蛋白富集效果差，会大量丢失。另外, 有机溶剂的多次作用造成了蛋白质溶解性变差，同时也加剧了蛋白质的丢失。
　　方法3 丙酮沉淀法处理后样品，获得的双向电泳图谱显示, 蛋白点数多且清楚,（如图所标识方框内区域）尤其是低丰度蛋白的表达要优于前两种方法， 虽有纵向拖尾，分析可能和等电聚焦时除盐时间不足，导致盐离子干扰了蛋白的分离有关。
　　同时，本实验还对等电聚焦条件进行了优化分析。观察图2-C 可以发现，蛋白纯化后的图谱仍存在纵向条纹，分析可能是一向等电聚焦时除盐力度不够，样品中存在的盐离子干扰了二向凝胶电泳时蛋白的有效分离，所以继续对聚焦时间进行了优化，结果如图3 所示。
　　图显示了传统聚焦条件下的K562 细胞丙酮沉淀蛋白的2-DE 图谱，蛋白点模糊，边缘不锐利，且有横向拖尾迹象。这是因为盐离子的存在可以增加IPG 胶条的导电性，限制等电聚焦电压的上升，使得蛋白质在离子移出胶条之前不能聚焦，从而延长聚焦时间，并在双向电泳图谱中造成水平方向的纹理。这可能与传统聚焦条件时由于除盐时间短，盐离子干扰了蛋白的分离关系密切。因此，本实验改良了传统聚焦条件，增加了除盐过程的时间，并调低了二向的电压，延长了整个凝胶电泳中蛋白按分子量大小分离的时间。获得的图谱如所示，可以看出，聚焦条件的优化使得蛋白的分离达到了最大化，图谱所示蛋白点的分离良好，蛋白质点更为清晰，并有效减少了纵向和横向的拖尾现象。证明适当延长聚焦时的除盐时间和二向凝胶的蛋白分离时间可以使蛋白点更清晰，更加有利于蛋白质的分离。
　　为了验证此方法是否适用于其它细胞和组织，分别对墓头回干预的K562 细胞蛋白和小鼠S180 瘤组织蛋白进行双向电泳，图谱显示此方法能大大提高蛋白的溶解性，减少蛋白分离不完全以及由于盐离子等存在导致的拖尾等缺点。
　　
　　3 结论
　　
　　综上所述，本实验针对蛋白质双向图谱中的关键问题之一：细胞的提取裂解，比较了标准裂解法，和此基础上的丙酮沉淀法以及三氯乙酸/丙酮沉淀法三者的双向电泳图谱。结果显示，三种方法在高丰度蛋白的分离上区别不大，而丙酮沉淀法对低丰度蛋白的分离良好，图谱显示蛋白点多于其它两种方法。同时，针对传统聚焦条件提出了改进方案，延长除盐时间，减少了盐离子对蛋白分离的干扰，使蛋白在纵向按分子量大小分离时效果良好，获得了背景清晰，蛋白点分离良好的蛋白质图谱。并提取经墓头回干预的白血病K562 细胞和S180荷瘤小鼠瘤组织蛋白进行双向电泳，实验证明此方法切实可行。
　　本实验所采取的操作过程较之其他蛋白纯化方法更为简单，所涉及的分析纯试剂造价不高，结果可靠且重复性较好，为进一步进行白血病K562 细胞及其他细胞的的蛋白质组学研究提供了有益参考。

　　
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