诱导空间学习记忆损伤大鼠脑组织过激活及大豆异黄酮干预的保护性作用

　　0 引言
　　
　　研究表明，阿尔茨海默（Alzheimerps disease，AD）患者脑组织老年斑的主要成分β 淀粉样蛋白（β-amyloid peptides，Aβ）可能通过激活核转录因子-κB （NF-κB）发挥其对神经细胞的毒性作用[1]。NF-κB 是一种重要核转录调节因子，在机体氧化应激或其他损伤信号的刺激下，NF-κB 的抑制性蛋白（IκB）发生磷酸化和降解，释放出有活性的NF-κB（p65/p50）进入细胞核，作用于核靶基因，引起大量的炎症相关因子分泌，导致炎症反应[1-3]。当炎症反应累及海马区功能时，甚至在没有神经细胞死亡的情况下，都会引起学习和记忆障碍[4,5]。
　　前期研究显示，大豆异黄酮（soybean isoflavone，SIF）具有抗氧化和减少Aβ 阳性细胞数的作用[6]。异黄酮类植物化学物质能够抑制激活的巨噬细胞中NO 和前列腺素2 的产生[7]，另外研究报道，SIF 具有抑制炎症相关因子、调节免疫应答等[8]特性。这些研究均提示黄酮类等植物化学物具有显著抗炎症的能力，显示出其在预防和治疗炎症相关的神经退行性疾病中具有广泛的应用前景。因此，研究SIF 在炎症通路中的作用及机制对于预防和治疗AD 具有重大的现实意义。
　　本研究利用Aβ1-42 建立大鼠空间学习记忆损伤模型，采用SIF 灌胃干预处理，探讨SIF对Aβ 诱导的大鼠神经毒性作用的影响，研究SIF 对模型大鼠脑组织中重要炎症相关蛋白表达的影响，为揭示SIF 有效改善学习记忆能力的神经保护作用，提供科学的基础理论依据与实验数据。
　　
　　1 材料与方法
　　
　　1.1 主要实验试剂和仪器
　　SIF 购于华北制药厂，Aβ1-42 购于上海生物工程技术有限公司，NF-κB p65/p50 兔多克隆抗体（美国santa cruz 公司）；抗兔多克隆抗体（美国pormega 公司）。大鼠脑立体定位仪（美国FOREDOM 公司）、植入式胶囊渗透压泵2002 型（美国Alzet 公司）、凝胶成像分析系统（美国Alpha Innotech 公司）、梯度PCR 仪（德国bioRad 公司）、酶标仪（瑞士TECAN 公司）、电泳仪（美国BioRad 公司）等。
　　
　　1.2 试验动物与分组
　　健康雄性、3 月龄、SPF 级Wistar 大鼠32 只，按体重随机分为4 组：对照组、Aβ 模型组、SIF 干预组（SIF+Aβ 组）、SIF 单独处理组。动物购于军事医学科学院动物研究所，实验符合国家《实验动物管理条例》，并经首都医科大学动物伦理委员会认可。
　　
　　1.3 学习记忆损伤动物模型的建立及干预
　　SIF 干预组和SIF 组经灌胃SIF（80mg/kgbwd），对照组和Aβ 模型组灌胃同等量的羧甲基纤维素钠溶液，14 天后，Aβ 模型组和SIF 干预组采用微型注射泵在大鼠侧脑室区持续注射Aβ1-42（10μg）建立大鼠学习记忆损伤模型；对照组和SIF 组大鼠侧脑室注射等量的生理盐水。术后第2 天，每只大鼠肌肉注射青霉素8 万单位预防感染。14 天后，处理动物，股动脉取血，留取脑组织检测相应指标。
　　
　　1.4 Morris 水迷宫
　　水迷宫为直径130 cm，高50 cm 的水池，在水池壁上标明4 个入水点，由此将其等分为4 个象限，于第一象限中心置一个圆形平台，平台低于水面10 cm，水温22℃，水池周围参照物保持不变。定位航行试验：训练4 天 ，每天分别从4 个不同入水点将大鼠面向池壁放入水中，第5 天正式试验，记录大鼠2 min 内找到平台所需时间（即逃避潜伏期）及活动的总路程。空间探索试验：第5 天定位航行试验结束后撤除平台，由第3 象限放入水中，记录2 min 内大鼠穿越平台原来所在位置的次数。
　　
　　1.5 RT-PCR 分析
　　引物序列为：（premier 5.0 软件设计，上海生工生物工程技术公司合成）β-actin、IκB-α、p65、p50 基因的引物序列、退火温度及片段长度见。
　　总RNA 的提取：1）取100 mg 脑组织加1ml 的TRIzol 试剂，冰浴上操作使组织匀浆化；2）将匀浆样品在室温放置5min，加入0.2 ml 氯仿，用力振荡后常温放置2min，然后高速冷冻离心15min；3）将水样层转移到一个干净的试管中，加入0.5ml 异丙醇，室温放置10min，然后高速冷冻离心10min；4）移去上层悬液，用75%的乙醇洗涤RNA 沉淀，轻弹混匀样品后高速冷冻离心5min；5）弃去上清，室温干燥至半透明状，并以20μl 1‰ DEPC 水溶解RNA。
　　反转录和扩增：取1μg 总RNA，70℃ 10min 后放置冰上。配置20μl 逆转录反应体系，反转录形成cDNA；以cDNA 为模板进行PCR 扩增，获取PCR 扩增产物，经2%琼脂糖凝胶电泳（65V，80min），电泳完毕后，取出凝胶在紫外灯下观察结果并照相。结果采用FluorChem FC2 凝胶成像系统软件进行半定量分析，以β-actin 作为内参照，用目的基因与相应的β-actin 条带平均光密度比值表示目的基因mRNA 的相对表达量。实验重复5 次。
　　
　　1.6 Western Blot 分析
　　取适量脑组织，加裂解液后研磨管研磨，吸取匀浆后置于1.5ml 离心管中，4℃颠倒混匀40min，之后4℃ 16000g×15min 离心，上清即为总蛋白。BCA 法测定蛋白浓度后，加变性缓冲液煮沸5min 变性，-20℃保存。
　　10%SDS-PAGE 凝胶电泳，60V 湿转2h，5%脱脂奶粉室温封闭2h，分别加入小鼠抗大鼠IκB 抗体（1:1000），兔抗大鼠p65（1:500），兔抗大鼠p50（1:200），兔抗大鼠β-actin抗体（1:500）4℃孵育过夜，TBST 漂洗（10min×3），碱性磷酸酶标记抗小鼠和抗兔IgG（1:5000）室温孵育1 h，TBST 漂洗（10 min×3），碱性磷酸酶法显色。采用FluorChem FC2凝胶成像分析系统分析扫描结果，测定各条带积分光密度值，目的蛋白相对表达量为目的条带与内参β-actin 的光密度比值。
　　
　　1.7 统计学处理
　　用SPSS 11.5 统计软件包进行单因素方差分析（ANOVA），组间比较采用LSD 法，P＜0.05 表示显著性差异。实验数据均用means±SE 表示。
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 大豆异黄酮对Aβ 诱导的大鼠空间学习记忆损伤的保护作用
　　通过学习和训练，各组大鼠逃避潜伏期均逐渐缩短，但Aβ 模型组大鼠在5 天实验中逃避潜伏期均长于其他组，见图1；与对照组比较，Aβ 模型组第5 天的潜伏期和总路程显著延长（P<0.05）；与Aβ 模型组比较，SIF 干预组和SIF 组潜伏期和总路程明显缩短（P<0.05）。第5 天撤台后Aβ 模型组穿越平台次数明显少于对照组（P< 0.05），与Aβ 模型组比较，SIF干预组和SIF 组穿越平台次数明显增多（P<0.05。
　　
　　2.2 大豆异黄酮对Aβ 诱导大鼠脑组织IκB 和NF-κB 基因表达的影响
　　图可以看出，Aβ1- 42 明显下调NF-κB 抑制性蛋白（IκB）基因的表达，与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；而SIF 干预组和SIF 组中IκB 基因表达上调，与Aβ 模型组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。p65 和p50 基因表达各组之间差异无统计学意义，但在Aβ 模型组表达量均高于其他各组。
　　
　　2.3 大豆异黄酮对Aβ 诱导大鼠脑组织IκB-α 和NF-κB 蛋白表达的影响
　　Western blot 分析结果显示，与对照组比较，Aβ 模型组IκB-α 蛋白表达显著下调， p65和p50 蛋白表达下调，差异具有统计学意义（P<0.05）；而在SIF 干预组和SIF 组，IκB-α蛋白表达显著升高，p65 和p50 蛋白表达下降，与Aβ 模型组比较具有统计学意义（P<0.05）。
　　
　　3 讨论
　　
　　学习记忆和认知能力的进行性下降是阿尔茨海默（Alzheimerps disease，AD）的主要临床特征。Hardy[9]等提出的淀粉样蛋白级联学说认为，β 淀粉样蛋白（β-amyloid peptides，Aβ）在大脑皮层形成不可逆的沉积是AD 病理发生的早期关键性事件。AD 患者脑组织老年斑周围常伴随着小胶质细胞和星形胶质细胞的浸润[10]，提示脑内的炎症反应在促进AD发生发展中起到了一定的作用，但到目前为止关于炎症反应在AD 中的作用仍然不是很清楚。研究发现，Aβ 与学习记忆功能关系密切，脑内注射Aβ 可使小鼠产生与AD 相似的神经行为障碍和学习记忆缺损症状[11]。本研究显示，SIF 能够明显改善Aβ 模型大鼠的学习记忆能力，下调炎症关键蛋白核因子-κB（NF-κB） 亚单位p65 和p50 的表达，上调NF-κB抑制性蛋白IκB-α 的表达。提示SIF 对于Aβ1-42 在大鼠中引起的学习记忆损伤具有神经保护作用。
　　Morris 水迷宫是用来准确评价学习记忆能力的经典方法[12]，定位航行实验通过检测大鼠逃避潜伏期和总路程来反映其获取空间信息和学习的能力，而空间探索实验检测大鼠跨越原平台位置的次数可以判断动物记忆贮存能力及提取再现能力。本研究结果显示，Aβ1-42可引起大鼠空间学习记忆能力明显降低，表现为大鼠逃避潜伏期和总路程显著延长，穿越平台次数显著减少， 而SIF 可以明显改善Aβ 模型大鼠的学习记忆能力。
　　NF-κB 是广泛存在于脑组织中的转录因子，如分布于神经细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞等 [13]。NF-κB 能够促进神经发育与神经的可塑性，并且和神经细胞的凋亡有关，在脑卒中、阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病中发挥重要作用[14]。
　　NF-κΒ 是由p50 和RelA 组成的异源二聚体。当细胞处于静息状态下，NF-κΒ 与其抑制蛋白（IκΒ）结合，以无活性的二聚体存在于胞质 [15]。研究报道Aβ 能够激活NF-κB，导致NF-κB 和IκΒ 解离，释放出有活性的NF-κB，转入细胞核并且和相应的DNA 区域结合引起相应基因的转录，特别是炎症因子和细胞因子的转录[16]。在本研究中发现，与对照组比较，Aβ 模型组p65 和p50 蛋白表达增高，但基因水平无显著差异；而NF-κB 的抑制性蛋白IκΒ在基因和蛋白水平表达均显著下降；相反在SIF 干预组，Aβ 对于p65/p50 蛋白和IκΒ 蛋白的作用均被抑制。本研究结果提示，SIF 能够抑制Aβ 对于炎症相关蛋白的调节作用，从而抑制其对神经的毒性作用。
　　综上所述， SIF 可能是通过抑制炎症相关蛋白（NF-κB）的高表达和上调IκΒ，拮抗Aβ1-42 介导的神经毒性作用，进而改善大鼠的空间学习记忆能力，发挥其神经保护作用。

　　
　　[参考文献]
　　[1]KIM HS, LIM JY, SUL D, et al. Neuroprotective effects of the new diterpene, CBNU06 againstbeta-amyloid-induced toxicity through the inhibition of NF-kappaB signaling pathway in PC12 cells[J]. Eur JPharmacol, 2009, 622(1-3): 25-31.
　　[2]BERGHE WV, NDLOVU MN, HOYA-ARIAS R, et al. Keeping up NF-kB appearances: Epigenetic control ofimmunity or inflammation-triggered epigenetics[J]. Biochemical pharmacology, 2006, 72(9):1114-31.
　　[3]DU Y, CHEN X, WEI X, BALES KR, et al. NF-(kappa)B mediates amyloid beta peptide-stimulated activity ofthe human apolipoprotein E gene promoter in human astroglial cells[J]. Brain Res Mol Brain Res, 2005,136(1-2):177-88.
　　[4]MCGEER PL, ROGERS J, MCGEER EG, et al. Inflammation, anti-inflammatory agents and Alzheimer disease:the last 12 years[J]. J Alzheimers Dis, 2006, 9(3 Suppl):271-6.
　　[5]TANAKA S, IDE M, SHIBUTANI T, et al. Lipopolysaccharide-induced microglial activation induces learningand memory deficits without neuronal cell death in rats[J]. J Neurosci Res, 2006, 83(4):557-66.
　　[6] MA WW, XIANG L, YU HL, et al. Neuroprotection of soyabean isoflavone co-administration with folic acidagainst beta-amyloid 1-40-induced neurotoxicity in rats[J]. Br J Nutr, 2009, 102(4): 502-5.
　　[7]BLAY M, ESPINEL AE, DELGADO MA, et al. Isoflavone effect on gene expression profile and biomarkers ofinflammation[J]. J Pharm Biomed Anal, 2010, 51(2): 382-90.
　　[8]VALSECCHI AE, FRANCHI S, PANERAI AE, et al. Genistein, a natural phytoestrogen from soy, relievesneuropathic pain following chronic constriction sciatic nerve injury in mice: anti-inflammatory and antioxidantactivity[J]. Journal Neurochemistry, 2008, 107(1):230-240.
　　[9] HARDY J, SELKOE DJ. The amyloid hypothesis of Alzheimersdisease: progress and problems on the road totherapeutics[J]. Science, 2002, 297(5580):353-356.
　　[10]STREIT WJ, GRAEBER MB, KREUTZBERG GW. Functional plasticity of microglia: a review[J]. Glia,1988, 1(5):301-7[11] HUANG HJ, LIANG KC, CHEN CP , et al. Intrahippocampal administration of Aβ1240 impairs spatiallearning and memory in hyperglycemic mice[J]. Neurobiology of Learning and Memory, 2007, 87 (4):483-494.
　　[12] SNIHUR AW, HAMPSON E, CAIN DP. Estradiol and corticosterone independently impair spatial navigationin the Morris water maze in adult female rats[J]. Behav Brain Res, 2008, 187(1): 56-66.
　　[13]ONEILL LA, KALTSCHMIDT C. NF-kappa B: a crucial transcription factor for glial and neuronal cellfunction[J]. Trends Neurosci, 1997, 20(6): 252-258.