不同剂量对颞下颌关节炎软骨下骨的影响

　　0 引言
　　
　　骨骨关节炎(0steoarthritis，0A)是累及包括颞下颌关节(Temporomandibular joint，TMJ)在内的所有滑膜关节的非炎症性退行性病变[1,2]，以关节软骨退变和软骨下骨改变为主要病理特征，可导致严重的关节疼痛和关节运动障碍。传统的保守治疗及手术治疗只能缓解其症状，效果不甚理想。
　　转化生长因子(Transforming growth factor-beta ,TGF-β)在调控细胞增殖、分化、粘附、凋亡以及细胞外基质合成和组织修复方面发挥重要作用[3,4]。近年来的研究表明TGF-β1 具有抑制多种炎性介质(ILl、MMPs)的活性及免疫反应等多重生物学功能[5,6]。而关节腔内注射TGF-β1 可以促进蛋白聚糖(PTG)的合成和增加关节软骨中PTG 的含量[7]。软骨下骨改变在骨关节病的发生发展中起着十分重要的作用，但到目前为止，未见任何文献报道关节腔内注射TGF-β1 对关节软骨下骨影响的研究。因此，本实验通过关节腔内注射不同剂量TGF-β1研究其对关节软骨下骨微结构的影响。
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 实验动物与分组
　　选取成年雄性新西兰大白兔36 只，体重约2.5-3.2kg,。实验前饲养一周，观察无咬合错乱，无全身疾患，动作敏捷者纳入实验。
　　
　　1.2 TMJOA 建模手术方法
　　按照1ml/kg 剂量于兔耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠对动物进行全身麻醉，在双侧耳前区备皮、消毒、铺巾。自眼外眦外侧5cm 至外耳道方向做1.5-2.0cm 切口，分离皮下组织，显露颞下颌关节囊。水平切开关节囊，显露关节上腔，将下颌升支推向外侧，以充分暴露关节盘。将关节盘前外1/3 部分切除形成穿孔，直径1.5mm。生理盐水冲洗创腔，分层缝合。术后肌注青霉素40 万u×2 次/d×3d。术后饲养常规颗粒饲料。
　　
　　1.3 实验方法
　　36 只新西兰大白兔随机分为3 组，全部采用双侧关节盘部分切除法建立TMJOA 动物模型。建模四周以后三组动物分别采用右侧关节腔内注射20, 40, 和 80 ng TGF-β1。对照侧关节腔内注射等量生理盐水。另取四只动物作为正常对照组。关节腔注射药物后分别于6周、12 周每组处死6 只动物，进行组织学以及microCT 检测。
　　
　　1.4 组织学观察
　　兔颞下颌关节标本置10 % 福尔马林中固定后,5 % E D T A 脱钙4 ~5 周,酒精逐级脱水，石蜡包埋进行5um 厚连续矢状切片, 随后行番红 O 染色,光镜观察。
　　
　　1.5 Micro CT
　　钙化软骨下0.5mm 以下定义为软骨下松质骨。感兴趣区域（ROI）定义为由钙化软骨下0.5mm 向远中延伸3mm。应用micro-CT 80（瑞士）对感兴趣区域进行扫描。分析参数包括骨体积分数（bone volume fraction，BV/TV），骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb．Th），骨小梁空隙（trabecular spacing Tb.Sp）以及骨表面密度（ bone surface density BSD）。
　　
　　1.6 统计学分析
　　采用SPSS 1 1 ．0 统计软件进行统计学分析, 结果以x ± s 表示。应用Kruskal-Wallis检验对实验组、对照组、正常组不同时间点的结果加以分析。P < 0.05 为差异具有统计学意义。
　　
　　2 结果
　　
　　所有实验动物均未出现伤口感染等并发症，动物手术当天即可进食，术后1~2 天进食稍有影响，3~4 天后即恢复正常。
　　
　　2.1 组织学
　　6 周时，单纯注射生理盐水组纤维软骨较薄，排列杂乱，番红染色较弱。20 ug TGF-β1注射组纤维软骨层增厚，软骨细胞明显增多。其软骨基质番红着色明显强于正常对照组及单纯注射生理盐水组。40 ug TGF-β1 注射组纤维软骨层较20 ug TGF-β1 注射组则更厚，软骨基质番红O 着色更加明显，软骨细胞数量更多。而80 ug TGF-β1 注射组与同期40 ug TGF-β1注射组无明显差异。12 周时，单纯注射生理盐水组关节软骨退行性改变更加明显，表现为纤维软骨更薄，排列更加杂乱，番红O 染色更弱，少量软骨细胞散在分布于软骨深层。几乎所有TGF-β1 注射组软骨层厚度较6 周是有所降低，但关节软骨细胞层次清楚,且各组间无明显。
　　
　　2.2 Micro CTMicro CT
　　扫描显示关节盘部分切除法对兔颞下颌关节髁突软骨下骨微结构可造成明显影响（图.1A 和B）。与正常对照组髁突比较，单纯注射生理盐水组6 周标本其BV/TV（图.1C）、Tb．Th（图.1D）以及BSD（图.1F）明显增高，而Tb.Sp 却明显减低(图.1E)。这些差异在12 周表现的更加明显。Micro CT 扫描结果显示注射TGF-β1 对髁突软骨下骨微结构有明显的修复作用。所有不同TGF-β1 注射剂量的各组其软骨下骨微结构与正常组对比未见明显差异。而这种治疗效果一直延续到12 周。
　　
　　3 讨论
　　
　　以往的体外研究显示TGF-β 能促进软骨细胞增殖并诱导其分泌软骨基质。与此相反，也有研究证实关节腔内注射TGF-β 可以诱导小鼠关节软骨OA 样病变[8]。同时也有研究证实TGF-β 在正常软骨中高度表达，而在OA 软骨中微量表达甚至不能检测到TGF-β。因此，关节腔内注射TGF-β 可以作为一种治疗手段运用于OA 软骨的修复，但运用于正常软骨中是不合适的。另外，我们的研究也发现TGF-β 注射组其组织学结果证实关节软骨层较正常组厚，但却不如正常组关节软骨细胞排列整齐。这些结果表明关节腔内注射TGF-β 可以促进关节软骨的修复，但却不能够使其完全恢复正常软骨的结构。众多研究均发现在人类骨关节炎和动物OA 模型的发病过程中软骨下骨参与并发挥重要作用。但是，到目前为止，没有任何报道研究其在TMJOA 发病过程中的作用。本次研究发现与正常对照组比较，单纯注射生理盐水组6 周标本其软骨下骨存在明显差异，而且这种差异在12 周时更加明显。这种软骨下骨微结构的改变和软骨病变程度是有明显关联的。骨体积分数、骨小梁厚度、骨表面密度的增高和骨小梁空隙的降低共同导致软骨下骨硬度增加，这就使得附于其上的软骨在TMJ 负荷时承受更大的应力，从而加速软骨基质的降解。这些结果有力地证明了和其它关节[9]的OA 病变一样TMJOA 的发病过程中软骨下骨同样扮演重要角色。
　　在本次试验中我们发现TGF-β1可以在整个为期12 周的实验过程中保持软骨下骨微结构相对正常的状态。而软骨下骨微结构正常状态的维持对于保护覆盖于其上方的关节软骨具有重要意义。例如，软骨下骨骨硬化可以导致软骨破坏，降解。因此，在本次实验中，TGF-β1注射组其修复关节软骨的效果明显，究其原因可能是TGF-β1 通过维持软骨下骨微结构的正常状态从而发挥修复软骨的作用。
　　
　　4 结论
　　
　　综上所述，在实验性颞下颌关节骨关节炎中，关节腔内注射TGF-β1 可以作为一种有效的保护软骨下骨微结构的有效方法。这为临床上运用TGF-β1 治疗骨关节病开辟了一条新颖而有效的途径。

　　
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