复方阿胶浆对移植性lewis肺癌组织VEGF表达影响

　　摘要：目的：观察复方阿胶浆联合化疗对移植性lewis 肺癌组织VEGF 表达的影响。方法：构建lewis 肺癌移植瘤模型，随机分为模型对照、环磷酰胺组、复方阿胶浆组、复方阿胶浆大剂量联合环磷酰胺、复方阿胶浆中剂量联合环磷酰胺、复方阿胶浆小剂量联合环磷酰胺共6 组。给药结束后，取瘤组织石蜡包埋、切片，HE 染色，光镜下观察组织形态；取4 组，以免疫组化染色法观察VEGF 蛋白表达。结果：环磷酰胺、复方阿胶浆中剂量联合环磷酰胺组较模型对照组VEGF 表达明显下降（p<0.05），复方阿胶浆组与模型对照组比较，无统计学意义（p>0.05）。结论：复方阿胶浆抑制lewis 肺癌生长可能与降低VEGF 表达无关，但伍用化疗后仍可保持化疗药物对VEGF 表达的下调作用。
　　
　　关键词：复方阿胶浆；移植性lewis 肺癌；VEGF
　　
　　0 引言
　　
　　实验研究表明，复方阿胶浆对小鼠可移植性肺癌、肉瘤[1,2]等具有良好的抑瘤效果，在S180 治疗中对环磷酰胺有协同增效作用。我们前期实验已观察了复方阿胶浆联合环磷酰胺对Lewis 肺癌的抑瘤作用，疗效显著，为进一步探讨复方阿胶浆及联合用药的抗肿瘤机制，选用血管内皮生长因子（VEGF）作为检测指标，来观察复方阿胶浆的作用机制是否与抗新生血管生成有关。
　　
　　1 材料
　　
　　1.1 动物与瘤株
　　清洁级雄性 C57BL/6 小鼠60 只，体重15-18g，购于中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心(许可证号：SCXK（军）2007-004)，于中国医学科学院肿瘤研究所SPF 级动物室饲养。Lewis 肺癌 (Lewis Lung carcinoma LLC)瘤源由中国医学科学院肿瘤研究所提供。
　　
　　1.2 试剂与仪器
　　复方阿胶浆（阿胶、党参、人参、熟地、山楂），20ml/支，山东东阿阿胶股份有限公司制备并提供，批号091146；注射用环磷酰胺（CTX），200mg/支，山西普德药业有限公司，国药准字H14023686。VEGF 一抗为兔抗鼠多克隆抗体；兔链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(streptavidin-peroxidase，SP)试剂盒SP900l；二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色剂（AR1022）；0.01mol/l PBS(pH 7.2～7.4)和枸橼酸盐缓冲液(AR0024)均购自武汉博士德公司。Olympus 公司IMT-2 倒置显微镜；美国Diagnostic Instrument Inc Spot-II 数码成像系统。
　　
　　2 方法
　　
　　2.1 造模
　　荷 LLC 的C57 小鼠脱颈处死，完整剥离瘤块，无菌取瘤组织以生理盐水研磨，调细胞密度约2×107/ml（台盼蓝计数活细胞>90%），每只小鼠右腋皮下接种0.2ml[3]。
　　
　　2.2 分组与给药
　　接种后第 3 日，按体重随机分为6 组，分别为模型对照组、CTX 组、复方阿胶浆组（中剂量）、复方阿胶浆（大、中、小剂量）联合CTX 组，并开始给药。模型对照组每日予生理盐水0.4 ml，共灌胃12 天；CTX 组，隔日腹腔注射0.2ml，共给药6 天（CTX 给药剂量为35mg/kg）；复方阿胶浆大、中、小剂量分别予原液0.4ml、0.2ml、0.1ml 灌胃，再分别予生理盐水0ml、0.2ml、0.3ml 补足（正常人体用量为60ml/d，每20ml 液体中约含阿胶3g）。以上给药剂量均按照人鼠体表面积折算。
　　
　　2.3 观察指标
　　2.3.1 瘤组织病理学观察取瘤组织以 10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋、切片，伊红、苏木素染色，光镜下观察。
　　2.3.2 移植瘤 VEGF 免疫组化检测切片选择模型对照、CTX、复方阿胶浆、CTX 联合复方阿胶浆中剂量组进行VEGF 蛋白染色，染色步骤参照SP 法试剂盒，VEGF 的稀释浓度为1：25。以PBS 代替一抗作为阴性对照。所有切片均在同一批次、同一批试剂、同一条件下完成染色，在光镜下观察阳性反应呈棕黄色。封片后以美国Diagnostic Instrument Inc Spot-Ⅱ数码成相系统拍照，观察VEGF蛋白表达。以Universal Imaging Corporation Meta Morph 分析系统对结果进行半定量分析，每张片子取5 个视野，在400（40×10）倍显微镜下，设置统一阈值分析阳性信号的平均光密度(AOD)，以5 个视野的平均值作为该片的数据。
　　
　　2.4 统计学方法
　　实验数据以x ± s表示。用SPSS 10.0 软件进行统计分析，多组均数比较采用单因素方差分析，p<0.05 表示有统计学意义。
　　

　3 结果
　　
　　3.1 复方阿胶浆联合 CTX 对LLC 组织结构的影响
　　光镜下，模型组瘤细胞排列紧密，核分裂易见（约8-20 个/HP），异型性明显，核固缩、核碎裂较少见，有点灶状坏死，癌组织中血管较丰富；CTX 组瘤细胞排列较为稀疏，核分裂较模型组减少(约5-10 个/HP)，可见较多核固缩、核碎裂，癌细胞呈片状坏死，偶可见巨细胞；复方阿胶浆及联合用药各组肿瘤组织结构较相似，瘤细胞呈团、巢状排列，可见大片状坏死区，范围较CTX 组扩大，核固缩、核碎裂易见，血管较模型组减少。
　　
　　3.2 复方阿胶浆联合 CTX 对LLC 组织VEGF 表达的影响
　　VEGF 阳性反应为黄色到棕褐色，定位于胞浆。实验结果表明, 与模型对照组比较, CTX、复方阿胶中剂量联合CTX组能够明显下调VEGF 表达( P<0.05) ；复方阿胶中剂量联合CTX组与CTX 组比较，无统计学意义(P >0.05)。可以看出复方阿胶浆可能不是通过下调VEGF的表达来发挥抗肿瘤作用的。见表1, 免疫组化染色见彩图2。
　　
　　4 结论
　　
　　新生血管的形成与肿瘤细胞的无限增殖密切相关，肿瘤新生血管的生成是一个复杂的过程，大致分为三步：①血管周围细胞外基质的降解；②内皮细胞的增殖、迁移；③毛细血管的分化吻合。近年发现许多新生血管因子及血管生成抑制因子有40 余种，血管生成因子包括血管内皮细胞生成因子(VEGF/VPF)，酸性及碱性成纤维细胞生成因子(aFGF、bFGF)，血小板源性内皮细胞生成因子(PD-EGF)，胎盘生成因子(PIGF)，表皮生成因子(EGF)，血管生成素(angiogenin)，肿瘤坏死因子(TNF-α)，白介素-8(IL-8)，基质金属蛋白酶(MMP)等。其中最主要的是VEGF，属外分泌蛋白，多种细胞均含有，但通常只有肿瘤细胞才能释放[4]，其通过与VEGFR（主要是VEGFR2）结合，逐级传递促血管生成的信号，进而调控血管内皮细胞的增殖、水解基底膜、参与细胞迁移和血管构建，从而调节病理性血管生成，促进肿瘤的转移，是目前发现的最强烈且特异性最高的血管生成因子[5]。在肺癌的相关研究[6]中发现，VEGF 主要表达于肺癌细胞质，呈明显异质性，与肺癌肿瘤血管形成关系密切。许多研究[7-12]表明，非小细胞肺癌患者较健康人群VEGF 表达明显升高，VEGF 在肺癌组织中呈强阳性表达，阳性率为67.9-70.2%，且VEGF 的表达水平与肺癌的预后关系密切，可能与肺癌淋巴结转移及复发有关。因此，如何下调VEGF 表达水平进而抑制肿瘤新生血管生成就成为了恶性肿瘤治疗的一个重要方向。目前已有近30 种血管生成抑制剂进入Ⅰ～Ⅲ期临床试验[13]，已经上市的抗血管生成药物如贝伐单抗、范得他尼、恩度等，毒副作用较低，应用较安全，在一定人群中效果尚佳。但是上述药物一般价格昂贵，且存在一定的耐药性，作用靶点单一，使得部分患者临床疗效并不满意。因此，寻找价格低廉，且不易产生耐药的抗血管生成新药是近几年研究的一个重要方向。
　　本实验采用lewis 肺癌移植瘤模型，用免疫组化法检测VEGF 的表达，从抗血管生成途径探索复方阿胶浆的抗瘤机理。实验结果显示，模型对照组VEGF 阳性表达数量最多，CTX及CTX 联合复方阿胶浆中剂量组可下调VEGF 表达(P<0.05)；复方阿胶浆组与模型对照组比较，无统计学意义（p>0.05）；联合用药与单用CTX 比较无统计学差异(P>0.05)。综合上述实验结果，得出结论：本实验未发现复方阿胶浆对肺癌组织VEGF 表达的影响，可能与复方阿胶浆的给药剂量，肿瘤负荷有关，今后可适当增加复方阿胶浆的给药剂量，并联合其它血管生成因子进行研究，以期有新的发现。

　　
　　[参考文献]
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　　[2] 刘培民，蔡宝昌等. 复方阿胶浆对Lewis 肺癌的抑瘤作用研究[J].中药药理与临床，2005，21（5）：44～45.
　　[3] Rodrigo Garzon M，Tirapu Fernondez de la Cuesta I，Arina Iraeta A，et al. Use of gene therapy in asubcutaneous murine model of lung cancer[J].Arch Bronconeumol，2006，42（10）：526～532.
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　　[5] Robinson CJ，Stringer SE. The splice variants of vascular endothelial growth factor(VEGF)and theirreceptors[J]. Cell Sci，2001，114(Pt5)：853～865.
　　[6] 杨东霞，韩艳春，刘鲁英，等. Elf-1 和VEGF 在非小细胞肺癌组织中的表达及意义[J].癌症，2009，28(7)：762～767.
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