氧化抗氧化系统在家兔动脉粥样硬化建模过程中的调控时效性研究
氧化抗氧化系统在家兔动脉粥样硬化建模过程中的调控时效性研究
摘要：目的 研究不同抗氧化酶在家兔动脉粥样硬化模型中的调控时效性，并进一步探讨氧化/抗氧化系统在动脉粥样硬化发病中的相互作用机制。方法 将24 只日本大耳白兔随机分为正常组和实验组，实验组给以高脂饲料，行球囊拉伤术，同时静脉注射牛血清白蛋白；分别在建模0 周、3 周、6 周、10 周四个时间点耳缘静脉采血，分光光度计检测血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、总抗氧能力（T-AOC）、过氧化氢酶（CAT），酶联免疫吸附法（ELISA）测定氧化低密度脂蛋白(oX-LDL)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)。结果 与正常组相比，实验组家兔氧化应激作用增强，SOD 水平在第3、10 周时降低，NO 水平在第3、10 周时增高，尤其至第10 周时此水平大幅增加，T-AOC、CAT 在10 周末明显升高，MDA、ox-LDL 水平在各时间点均增高(P<0.05 或P<0.01)，GSH-Px 与正常组比较没有显著的统计学意义（P＞0.05）。讨论 实验组家兔在动脉粥样硬化模型建立过程中，体内存在着明显的脂质过氧化损伤，氧化/抗氧化系统失衡，不同抗氧化酶可能在不同的时间窗代偿性表达，以对抗活性氧对机体的损伤。
关键词：动脉粥样硬化；氧化/抗氧化系统；家兔；模型；氧化应激
越来越多的研究表明，在动脉粥样硬化(Artherosclerosis,AS)和急性冠脉综合症(AcuteCoronary Syndrome,ACS) 有关的心血管功能障碍的发生发展中，氧化应激(OxidativeStress,OS)起了重要的作用[1-3]。机体的氧化应激是指由于氧自由基过量生成、细胞内抗氧化防御系统受损等导致氧自由基及其相关代谢产物过量聚集，从而对细胞产生多种毒性作用的病理状态。健康人体内存在着强大的抗氧化酶系统，它们可通过单独或协同作用清除体内氧自由基(O2-)，从而保护机体免受氧自由基的损伤。当各种原因导致血管内皮损伤时，机体产生过多的氧自由基，为了清除氧自由基，超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase,GSH-Px)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)等抗氧化物酶在早期代偿性高表达，而后随着氧自由基的进一步产生，抗氧化酶被大量消耗，进而导致机体过量的活性氧(ROS)与内源性清除氧自由基的抗氧化系统失去平衡，进一步加剧动脉粥样硬化及相关疾病的发展[4-6,11]。本研究以高脂、球囊拉伤及免疫损伤干预日本大耳白兔，动态观察了日本大耳白兔动脉粥样硬化模型建立过程中体内氧化酶的变化，旨在进一步探讨氧化/抗氧化酶系在体内的实时水平，为临床治疗动脉粥样硬化性相关疾病提供思路。
1 材料与方法
1.1 材料普通级雄性日本大耳白家兔24 只，体重2.1±0.2kg，由北京市维通利华实验动物中心提供，许可证编号SCXK(京)2007-0001；高脂饲料由天津中医药大学实验动物中心配制，配方：1%胆固醇+5%猪油+5%蛋黄制备；胎牛牛血清蛋白（Albumin Bovine fraction Ⅴ）购自上海生工生物工程技术服务有限公司；血清总胆固醇(Total Cholesterol,TC)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、一氧化氮(Nitricoxide,NO)、总抗氧能力（T-AOC）、过氧化氢酶（CAT）测定试剂盒均南京建成生物技术有限公司；氧化低密度脂蛋白(Oxidative LowDensity Lipoprotein,oX-LDL)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)ELISA 试剂盒购自美国R&D 公司。
1.2 分组与建模方法大耳白兔适应性喂养1 周后，采用计算机随机数字法随机分成正常组8 只、实验组16只。采用高脂饲料加免疫损伤和动脉内皮损伤术建立兔动脉粥样硬化模型。予普通饲料适应性饲养1 周后，正常组继续给予普通饲料，实验组给予高脂饲料，日均为150 克（早：100g/只/日，晚：50 g/只/日），所有动物均单笼饲养，饮水不限，自由摄食。实验组予高脂饲料1 周后，耳缘静脉一次性注射胎牛血清250mg/ml/kg，异体血清致免疫炎症损伤。在免疫损伤1 周后进行球囊拉伤内皮损伤术。
1.3 标本采集所有大耳白兔分别于实验开始、3 周、6 周、10 周末采血。每次采血前禁食12h，经耳缘静脉抽血3ml，静置1h 后3000r/min 离心10min 提取血清，置于-80℃冰箱冻存备用；在第10 周末取材，用3%戊巴比妥钠(30mg/ml/kg)麻醉成功后，取出主动脉血管组织，沿纵轴剪开，生理盐水冲洗后置于10%中性福尔马林固定。
1.4 试验方法
1.4.1 HE 染色石蜡切片常规脱蜡至水，苏木精染色5min，自来水冲洗，70%的盐酸乙醇分色30s，水洗后酸化伊红复染10min，水洗、脱水、透明、中性树胶封片。
1.4.2 酶比色法检测分光光度计检测血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、总抗氧能力（T-AOC）、过氧化氢酶（CAT），一氧化氮(NO)用硝酸还原酶法，超氧化物歧化酶(SOD)采用黄嘌呤氧化酶法
1.4.3 酶联免疫吸附法氧化低密度脂蛋白(oX-LDL)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)均采用ELISA 法，严格按照试剂盒说明步骤进行。
1.5 统计学处理采用 SPSS 11.5 统计分析软件处理，计量数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较用单因素方差分析。
2 结果
2.1 一般情况正常组 8 只，死亡2 只；实验组16 只，死亡6 只；其死亡时间大都集中在4 至6 周前后。其他实验动物手术创口愈合良好，未感染任何其他疾病。实验组与正常组动物体重随时间变化呈增长趋势，但同一时间点两组间体重比较差别不大，无统计学意义(P>0.05)。可以证实此干预因素基本未影响实验兔的正常生长。
2.2 建模过程中两组家兔血脂变化实验组血清总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）随着时间的延长表达水平逐渐升高(P<0.05 或0.01)，与同一时间点对照组相比较，在3 周、6 周、10 周时血脂水平差异均有显著的统计学意义(P<0.05 或0.01)，而正常组血脂前后无显著变化。在第10 周时，实验组TC 和LDL-C 均较正常组升高22 倍左右。
2.3 血清SOD、MDA、ox-LDL、NO 的变化两组动物分别在0 周、3 周、6 周、10 周末检测ox-LDL、SOD 活性、MDA，结果显示：与空白组比较，实验组ox-LDL 在3 周、6 周、10 周时水平均明显增高(P<0.01)；MDA 含量逐渐升高，在第6 周时尤为明显(P<0.01)，3 周和10 周与空白组比较差异也具有统计学意义(P <0.05)；实验组SOD 活力呈逐渐下降趋势，在3 周和10 周与空白组比较有显著性差异(P<0.05) 。
2.4 10 周末血清CAT、T-AOC 活性的变化与正常组比较，实验组CAT、T-AOC 活性明显升高(P<0.01)，GSH-Px 水平有升高趋势，但差异无显著的统计学意义(P＞0.05)。
2.5 主动脉形态学观察
2.5.1 主动脉大体观察在第 10 周末取材中发现正常组的主动脉柔韧均匀，颜色粉红，纵切后肉眼可见内膜光滑鲜亮。而实验组的主动脉粗细不均，血管明显增粗、变脆，外壁黄白相间、凹凸不平，纵切后肉眼可见管壁明显增厚、黄白色条纹或大小不等的黄白色脂质斑块向血管表面隆起。
2.5.2 图像分析苏丹III染色见实验组主动脉壁大部分被染成深红色，正常组主动脉内膜光滑，无深红色的病变区；实验组斑块面积大约占整个内膜的53.6%±10.5%，与正常组的内膜光滑相比相差甚远。切片分析结果显示(见表-2)，实验组主动脉弓、胸主动脉、腹主动脉各部位中膜厚度无明显变化，与正常组比较无统计学差异(P>0.05)，其厚度两组相一致，由高到低依次为主动脉弓、胸主动脉、腹主动脉，这与主动脉各部位的血管直径大小相一致；实验组各部位内膜都明显增厚(P<0.01)，内膜中膜厚度比、内膜增生指数增加与正常组相比有统计学差异(P<0.01)；以上三个数据表明一种趋势：腹主动脉病变最重，再者是胸主动脉，主动脉弓相比之下较轻。
3 讨论
高脂饲料加球囊拉伤建立腹主、髂AS 模型以及颈总动脉狭窄的模型广泛应用于AS 的研究[7-8]。另有报道[9]用高脂饲料加炎症刺激制作此病理模型，本实验模拟人AS 发病机制综合多种因素，以高脂饲喂叠加免疫生物损伤和内皮损伤的复合因素干预家兔，研究氧化/抗氧化系统在家兔动脉粥样硬化模型建立过程中的调控时效性。
氧化应激与 AS 的发生密切相关，贯穿了AS 的全过程，动脉脂质条纹的形成开始到严重病变处斑块的破裂[10-11]。SOD 为酶性抗氧化物质，能清除超氧阴离子，保护细胞免受损伤，通过测定SOD 活性的高低可间接反映机体清除氧自由基的能力。MDA 是脂质过氧化反应的主要代谢产物，其水平可间接反映出细胞受氧自由基损伤的程度，是反映氧化应激较好的指标[12]。T-AOC 则代表组织中总的抗氧化能力，可很好地反映机体防御系统抗氧化能力的强弱。CAT 是抗氧化应激酶系的重要成员之一[13-14]。ox-LDL 是低密度脂蛋白的氧化产物，它可激活内皮细胞，增强细胞黏附分子的表达，从而促进单核巨噬细胞的黏附和浸润，同时可刺激单核巨噬细胞表达基质金属蛋白酶，增加纤维帽内细胞外基质降解，削弱纤维帽抗损伤能力，使斑块易损性增加。另外，ox-LDL 还可进一步加剧血管粥样病变的炎症反应[15-17]。
在 AS 的发病过程中，SOD 清除氧自由基的能力降低，导致氧自由基大量蓄积，破坏细胞膜的生物功能，导致细胞损伤老化，氧化应激作用增强，MDA 等毒性物质产生增多，修饰LDL 形成ox-LDL。ox-LDL 激活炎性因子引起内皮的损伤[18-19] 。CAT 能将代谢过程中不间断产生的大量过氧化氢分解成水和分子氧，或者催化过氧化氢被供氢体分子所提供的氢原子还原，减轻和阻断脂质过氧化作用的一级引发作用，保护机体免受有机氢过氧化物的侵害，延缓细胞的衰老，从而预防自由基引发疾病的发生[12]。GSH-Px 是机体抗氧化酶系统的一种酶，在细胞浆中直接参与清除H2O2，减少羟自由基的产生，也可使脂质过氧化物分解减轻其毒性，GSH-Px 易受氧自由基O-2 攻击而失活，Judy B 课题组的研究发现，在ApoE 敲除的小鼠中，GSH-Px 基因的缺失加剧了AS 的发病，而C57BL/J6 系小鼠敲除GSH-Px 基因却没有增加AS 病变[20-21]。本研究提示，在高脂加球囊拉伤以及免疫损伤导致的AS 病变中，GSH-Px 水平仅有升高趋势，与正常组比较，差异并无显著的统计学意义(P＞0.05)。
本实验结果显示，AS 兔模型体内存在着明显的脂质过氧化损伤。血脂水平大幅上升，ox-LDL、MDA 血清含量呈时间依赖性增加，SOD 血清含量呈时间依赖性降低，但实验组10 周末CAT、T-AOC 活性明显升高(P<0.01)，这可能是CAT、T-AOC 的代偿性表达所致,GSH-Px 水平可能在AS 发病的氧化应激机制中不具有关键作用。研究进一步提示，动脉粥样硬化后机体发生的氧化应激可能在早期有一个代偿性高表达的过程，抗氧化系统可能存在应激保护时间窗。
参考文献
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