周记玲作者简介：周记玲（1987-），女，河南周口市人，研究生，从事土壤污染治理方面的研究（中国矿业大学 化工学院，江苏 徐州 221008）摘要：实验通过对净化条件、提取条件、色谱条件盠优化，建立了乜种土壤中辛硫磷残留量盠高效液相色谱分析昕洱。结果表明：样品经乙酸乙酯（100L）提取，石油醚+乙酸乙酯（1/9，）混合液（60mL）洗脱，中悃氧化铝层析柱净化后，采疄乙腈/水=（65/35，V/V）为流动相， ZORBAX? SB-C18（5μm，内径2.1mm×150mm）为色谱柱，在0.45mL? min-1 的流速时，用高效液相色谱—二极管阵列检测器垄280nm 波长下进行测定，得到基线平稳，峰徾对穌，与其它杂质能够完全分离盠睊标峰；当辛硫磷垄0.5-10μg? mL-1 浓度范围内时，回归昕程亖y=19.88392x+5.50191e-1，相关系旌亖0.99998，加标回收率达到87.0%。该分析昕洱简单、快速、准确、灵敏、适合土壤中辛硫磷残留量盠检测。
关键词： HPLC；辛硫磷；残留；土壤
引言辛硫磷（Phoxim）是一种高效、低毒、低残留广谱有机磷杀虫剂，且能与多种农药进行混配，因此在果树及蔬菜生产上应用广泛，成为农业生产上应用较多的杀虫剂之一[1,2]。
我国以及美国、澳大利亚、欧盟等许多国家和组织都制定了该农药残留量标准。辛硫磷残留量的测定方法很多，有气相色谱法、液相色谱法、极谱法、薄层色谱法、酶抑制法等，但极谱法和薄层法灵敏度较低，酶抑制法容易出现假阴性和假阳性[5-11]，满足不了辛硫磷残留量的准确测定。目前，国内外有关辛硫磷的残留分析方法主要是气相色谱法和液相色谱法，但由于辛硫磷高温下不稳定、易分解[12-14]，这给气相色谱分析带来一定困难。
近年来，国内外开始使用高效液相色谱法研究辛硫磷残留，例如邓丛蕊、张国兴[15-17]、王勇等对辛硫磷制剂的高效液相色谱分析进行了研究，HenryK ROTICH[18]、郭丽[19]等采用固相萃取―高效液相色谱方法对环境水样中辛硫磷等多种农药的残留进行了监测分析，王勇等采用硅胶柱净化浓缩胡萝卜汁，高效液相色谱-二极管阵列检测器分析辛硫磷的残留，等采用基质固相分散和液相色谱串联质谱对果汁中的农药残留进行了检测分析，都取得了良好的效果。但是有关土壤中辛硫磷残留量的高效液相色谱分析检测报告甚少。为此，本实验采用高效液相色谱―二极管阵列检测器研究了土壤辛硫磷残留量的监测分析方法，该方法操作简单、快速、准确、灵敏、重现性好，适合土壤中辛硫磷残留量的检测。
材料与方法主要仪器及试剂高效液相色谱仪，其配置为G1311A 四元泵、G1379A 在线脱气机、自动进样器、G1316A 柱温箱、G1315B 二极管阵列检测器和Agilent 化学工作站；型电子天平；气浴恒温振荡器；RE-52AA 型旋转蒸发仪；超纯水装置；微孔滤膜(0.45μm)。
辛硫磷标准品（含量99%），北京北化恒信生物技术有限公司提供，中国计量科学研究院检测；乙腈为色谱纯，石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙腈为分析纯；水为超纯水；中性氧化铝（粒度100-200 目）、无水硫酸钠：经650℃干燥4h，于干燥器中冷却至室温备用。中性氧化铝每100g 加5mL 水降活。
分析方法溶液的配制标准储备液：在分析天平上准确称取辛硫磷标样50mg 于50mL 容量瓶中，用色谱纯乙腈定容，即得辛硫磷标准储备液，其质量浓度为1000μg·mL-1。不用时放冰箱中冷冻保存。
标准使用液的配制：用移液管准确吸取5mL 标准储备液于50mL 容量瓶中，用色谱纯乙腈定容；用同样的方法再将所得溶液稀10 倍即得质量浓度为10μg·mL-1 的标准使用液。
土壤样品的处理研究用的土壤样品采自河南科技大学周山校区西侧某果园，经风干、去杂质、磨碎、混匀、过100 目分样筛，置于广口瓶中备用。
净化条件的优化根据实验要求，选定中性氧化铝层析柱作为本次实验的净化柱。
土壤净化柱从下至上依次装入：少量玻璃棉、2cm 高的无水硫酸钠、5g 中性氧化铝、高的无水硫酸钠。
洗脱液种类及用量的确定：
实验中选定了三种极性不同的洗脱液，分别为：石油醚+乙酸乙酯（1:9/V/V）混合液、乙酸乙酯、二氯甲烷。
首先用20mL 已选定的洗脱液淋洗中性氧化铝层析柱，然后加入0.3mL 辛硫磷标准使用液于净化柱中，再用该洗脱液洗脱，用浓缩瓶依次收集洗脱液，每个浓缩瓶收集20mL。将收集的洗脱液在旋转蒸发仪上蒸发近干后，氮气吹干，用2mL 乙腈溶解瓶内残留物，其溶液用0.45μm 过滤头过滤后供HPLC 分析。根据色谱图分析，以确定最佳洗脱液的种类及用量。
提取条件的优化本实验依据辛硫磷的溶解特性，采用多种有机溶剂（石油醚、乙酸乙酯、乙腈）分别进行提取实验，比较不同溶剂分别在60mL、80mL、100mL 三个用量等级下提取土壤中辛硫磷的加标回收率，以确定本实验最佳提取剂的种类及用量。
以石油醚，用量60mL，同时做五个平行样为例：
用电子天平准确称取20g 土壤样品于具塞三角瓶中，准确加入0.3mL 辛硫磷标准使用液（相当于3μg 辛硫磷），60mL 石油醚和10g 无水硫酸钠，在回旋振荡器上振荡1 小时。
振荡提取后，过滤到50mL 比色管中，用移液管吸取提取液用量的一半，即30mL 滤液于浓缩瓶中，在旋转蒸发仪上蒸发近干，用氮气吹干。
吸取2mL 乙腈（分析纯）至上述蒸干的浓缩瓶中，将残留物溶解并转移到已预淋洗过的净化柱内，用5×20mL 石油醚+乙酸乙酯（1:9）混合液洗脱柱内样品，收集全部淋出液，在旋转蒸发仪上蒸发近干，用氮气吹干，准确加入2mL 乙腈（色谱纯）溶解残留物，用0.45μ过滤头过滤后供HPLC 分析。
色谱条件的优化色谱柱：ZORBAX? SB-C18(2.1×150mm，5μm)；流动相：乙腈-高纯水（65/35,V/V）流速：0.45mL·min-1；进样量：4μL；检测波长：280nm ；柱温：30.0℃；保留时间：3.438min；定量方法：外标法。应用此色谱条件可获得较好的峰形和较短的保留时间。辛硫磷的标准色谱图见图1。
图1 辛硫磷标准品色谱图（10μg·mL-1）（10μg.mL-1）结果与分析净化条件的选择本实验在选定中性氧化铝层析柱为净化柱的前提下，比较了三种不同洗脱液石油醚+乙酸乙酯（1:9/V/V）混合液、乙酸乙酯、二氯甲烷的洗脱效果。结果表明：用石油醚+乙酸乙酯（1:9/V/V）混合液洗脱层析柱时，第2 个20mL 用量间隔所得的洗脱液中未检测到辛硫磷，证明20mL 石油醚+乙酸乙酯（1:9/V/V）混合液可以把辛硫磷洗脱完全。用乙酸乙酯洗脱层析柱时，第3 个20mL 用量间隔所得洗脱液中还可以检测到辛硫磷，证明在适量的洗脱液用量范围内，乙酸乙酯溶液不能将辛硫磷从层析柱上洗脱完全。而用二氯甲烷洗脱层析柱时，第3 个20mL 用量间隔所得的洗脱液中未检测到辛硫磷。故选取石油醚+乙酸乙酯（1:9，）混合液作为本次实验的洗脱液，并得到洗脱液的优化体积为60mL。
提取条件的优化比较了三种有机溶剂石油醚、乙酸乙酯、乙腈的提取效果，结果表明：采用乙酸乙酯提取样品，比用石油醚、乙腈的提取效率高，同时减少了色素、油脂等杂质的提取，为后续净化降低了难度。
色谱条件的选择色谱柱的选择实验中考察了ZORBAX? SB-C1（8 5μm，内径2.1mm×150mm）色谱柱与（5μm，内径4.6mm×150mm）等色谱柱的分离效果，结果表明：采用（5μm，内径2.1mm×150mm）色谱柱时，目标峰不仅保留时间短，出现在许多杂质峰的前面，而且峰形对称、分离彻底，实现了辛硫磷与其它干扰杂质的良好分离；并且由于其较小的内径，可以节约流动相的用量。
流动相的选择本实验中流动性的选择和优化，应以目标峰与其它干扰杂质峰完全分离为目的，因此目标峰必须和杂质峰之间保持合适的分离度。本实验考察了不同配比的甲醇/水、乙腈/水的流动相体系。结果表明：采用乙腈/水的流动相体系，基线平稳，色谱峰尖锐，峰形对称，分离彻底。本实验选择乙腈/水为流动相，分别考察了乙腈/水不同配比对分离情况的影响。结果表明：随着乙腈/水配比的减小，目标峰保留时间增加，当乙腈/水的配比小于65/35 时，保留时间明显增加，且峰形变宽，测定灵敏度降低。当乙腈/水的配比大于70/30 时，目标峰与杂质峰重叠。而当乙腈/水的配比等于65/35 时，目标峰不仅保留时间短，仅为3.438min，而且基线平稳，色谱峰尖锐，峰形对称，目标峰与杂质峰完全分离（见图2、图3）。因此本实验最终确定以乙腈/水=65/35 为流动相。
检测波长的选择利用二极管阵列检测器的扫描功能，得到辛硫磷标样的色谱图，发现在280nm 有一最大吸收，所以本次实验选择280nm 作为检测波长，可以保证有较高的灵敏度。
洗脱程序的选择经过反复探索，发现使用梯度洗脱时分离效果较好，洗脱程序见表1。
表1 梯度洗脱程序标准曲线及线性关系将适量辛硫磷标准使用液用0.45μm 的过滤头滤入2mL 的样品瓶中，分别在进样量为μL、0.5μL、1.0μL、2.0μL、3.0μL、4.0μL 下进行测定，在样品进样量为4.0μL 的前提下，该进样量系列与配制浓度为0.5、1.25、2.5、5.0、7.5、10μg·mL-1 的标准溶液系列相当。以辛硫磷质量浓度x（μg·mL-1）为横坐标，以吸收峰面积y 为纵坐标绘制工作曲线见图4。辛硫磷的线性回归方程与相关系数的测定结果见表2。
分析方法的准确度及精密度在空白的土壤样品中，添加已知含量的辛硫磷标准使用液，每个提取剂用量重复做次，按照上述规定的样品处理步骤操作，高效液相色谱测定其含量，计算其添加回收率及标准偏差，结果见表3。在最佳提取剂提取下，辛硫磷在土壤中的回收率较满意，重现性良好。
表3 辛硫磷在土壤中的添加回收率和标准偏差样本 采样量 原含量 加入量 提取剂 用量 回收率% 标准结论采用乙酸乙酯（100mL）提取土壤中辛硫磷样品，在选定中性氧化铝层析柱前提下，用石油醚+乙酸乙酯（1/9，V/V）（60mL）进行洗脱，采用ZORBAX? SB-C18（5μm,内径×150mm）色谱柱进行样品分离，乙腈/水（65/35，V/V）进行梯度洗脱，利用高效液相色谱—二极管阵列检测器在280nm 波长处检测样品，得到基线平稳，峰形对称，色谱峰尖锐的目标峰，并且目标峰保留时间短，仅为3.438min；利用本方法进行土壤中辛硫磷残留量的测定，准确度高，重现性好，获得了满意的结果。
参考文献贺敏, 戴荣彩, 余平中, 等. 玉米中辛硫磷残留的高效液相色谱方法研究. 农药科学与管理李静, 徐国锋, 聂继云, 等. 分散固相萃取―气相色谱法测定水果中辛硫磷农药残留量. 中国果树―2005 食品中农药最大残留限量. 北京: 中国标准出版社, 2005. GB 2763―主要贸易国家和地区食品中农兽药残留限度标准编委会. 主要贸易国家和地区食品中农兽药残留限量标准（上册）. 北京: 中国标准出版社（Volume one）黄士忠, 李志祥, 张俊亭. 蔬菜中乐果、辛硫磷残留测定方法研究. 农药环境保护
